まず、0日目に、ミックス1サイトカインを含む無血清分化培地またはSFD培地を摂氏37度に予熱します。次に、無菌組織培養フードの下で、Mix 1サイトカインを添加した培地を、細胞忌避剤6ウェルプレートの各ウェルに添加します。細胞を調製するには、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトIPS細胞を含む6ウェルプレートから培地を吸引します。
DPBSで洗浄した後、DPBSを吸引します。次に、解離試薬を細胞に添加し、室温で1分間インキュベートします。この解離試薬を吸引した後、細胞を室温でさらに3分間インキュベートします。
次に、細胞が入ったプレートを両側で10回タップして、細胞クラスターを取り外します。1ウェルあたり1ミリリットルのプレウォームしたMix 1サイトカインを添加したSFD培地を細胞に加えます。牧草地のピペットを使用して、細胞クラスターを各ウェルから、Mix 1サイトカインを含む培地を含む細胞忌避プレートの1つのウェルに移します。
プレートをインキュベーターに導入した後、プレートを前後および左右に動かして内容物を均一に分散させ、胚様体(EB)形成のためにインキュベートします。翌日、EBを含む細胞忌避剤プレートを旋回させ、ウェルの中央に集めます。パスツールピペットを使用して、EB 懸濁液をウェルから 15 mm リットルの遠心チューブに移します。
EBがチューブの底に落ち着くまで5〜10分待ちます。その間、細胞忌避プレートを滅菌水またはDPBSで洗浄して、単一の細胞または破片を除去します。2ミリリットルのミックス1サイトカインを添加したSFD培地をプレートの各ウェルに加えます。
次に、EBを外さずに遠心チューブから上清を静かに吸引します。Mix 1サイトカインを含むSFD培地の計算量にEBを再懸濁します。すでに2ミリリットルの培地を含む洗浄した細胞忌避プレートの各ウェルに、1ミリリットルのEB懸濁液を加えます。
前述したようにプレートを静かに動かしてEBを分散させた後、プレートをインキュベートします。ウェルの中央にEBを集めた後、細胞との直接接触を避けて、各ウェルの側面にカイロンを追加し、前に示したようにウェルをインキュベートします。分化の 3 日目と 6 日目に、EB を回収し、1 日目に示したように培地交換を行います。
3日目にはMix 3サイトカインを添加したSFD培地を使用し、6日目にはMix 4サイトカインを添加したSFD培地を使用します。前述したように、EBを細胞忌避プレートから15 mmリットルの遠心チューブに回収して沈殿させた後、上清を吸引し、チューブ内に回収したEBウェルあたり1 milliリットルの細胞解離試薬を添加してEBを再懸濁します。次に、このEB懸濁液1ミリリットルを、水洗した細胞忌避プレートの各ウェルに移します。
プレートをインキュベーターで10分間インキュベートした後、P1000ピペットを使用して、ピペッティングを10回以内で静かに上下させ、各ウェルのEBを解離します。次に、解離したEBのウェルあたり5ミリリットルの洗浄バッファーを添加します。細胞を40ミクロンのストレーナーに通し、50ミリリットルの遠心チューブに集めます。
ろ過した懸濁液中の細胞をカウントした後、細胞を300gで10分間スピンダウンします。細胞を300マイクロリットルの洗浄バッファーに静かに数回ピペッティングして再懸濁し、凝集物がないことを確認します。メーカーの指示に従って、CD34マイクロビーズキットを使用してCD34陽性細胞の単離に進みます。
良質のEBは、分化の2日目までに明確なエッジを示し、顕微鏡で観察すると明瞭で明るく見えました。暗い領域の存在は、EB内の細胞死を示しました。2日目にさまざまな濃度でカイロン処理を行った後、分化8日目にCD34陽性細胞の数を定量すると、処理に対する細胞株の応答が明らかになりました。
フローサイトメトリーでは、磁気ビーズを用いたCD34陽性濃縮により、約85%のCD34陽性細胞が得られることが示されました。
