Para começar, no dia zero, meio de diferenciação pré-quente sem soro ou meio SFD contendo citocina Mix 1 a 37 graus Celsius. Em seguida, sob uma capa de cultura de tecidos estéril, adicione o meio suplementado com citocinas Mix 1 a cada poço de uma placa repelente de células de seis poços. Para preparar as células, aspirar o meio de cultura de uma placa de seis poços contendo células STEM pluripotentes induzidas por humanos ou células IPS humanas.
Lavá-los com DPBS seguido de aspirar o DPBS. Em seguida, adicione o reagente de dissociação às células e incube-as à temperatura ambiente por um minuto. Após aspirar esse reagente de dissociação, incubar as células por mais três minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, toque na placa que contém as células 10 vezes de cada lado para separar os aglomerados de células. Adicione um mililitro de meio SFD pré-aquecido Mix 1 suplementado com citocinas às células por poço. Usando uma pipeta de pastagem, transfira os aglomerados celulares de cada poço para um poço da placa repelente de células contendo o meio com a citocina Mix 1.
Depois de introduzir a placa na incubadora, mova-a para frente e para trás, bem como de um lado para o outro, para dispersar o conteúdo uniformemente e incubá-lo para a formação de corpos embrionários, ou EB. No dia seguinte, gire a placa repelente de células contendo os EBs para coletá-los no centro dos poços. Usando uma pipeta pasteur, transfira a suspensão EB dos poços para um tubo centrífugo de 15 mililitros.
Aguarde de cinco a 10 minutos para que os EBs se acomodem no fundo do tubo. Enquanto isso, lave as placas repelentes de células com água estéril ou DPBS para remover células individuais ou detritos. Adicione dois mililitros de meio SFD suplementado com citocinas Mix 1 a cada poço da placa.
Agora, aspirar suavemente o sobrenadante do tubo da centrífuga sem deslocar os EBs. Ressuspender as EBs no volume calculado do meio SFD contendo a citocina Mix 1. Adicione um mililitro de suspensão de EB a cada poço da placa repelente de células lavada já contendo dois mililitros de meio.
Incubar a placa após dispersar os EBs, movendo suavemente a placa como mencionado anteriormente. Após a coleta dos EBs no centro dos poços, adicione o quíron na lateral de cada poço, evitando o contato direto com as células, incube os poços como demonstrado anteriormente. Nos dias três e seis de diferenciação, coletar os EBs e realizar as trocas de mídia conforme demonstrado anteriormente para o primeiro dia.
Use o meio SFD suplementado com citocinas Mix 3 no terceiro dia e use o meio SFD suplementado com citocinas Mix 4 no sexto dia. Após coletar e assentar os EBs da placa repelente de células em um tubo centrífugo de 15 mililitros, como demonstrado anteriormente, aspirar o sobrenadante e, em seguida, adicionar um mililitro de reagente de dissociação celular por poço de EB coletado no tubo para ressuspender os EBs. Em seguida, transfira um mililitro dessa suspensão de EB para cada poço da placa repelente de células lavada com água.
Depois de incubar a placa por 10 minutos na incubadora, use uma pipeta P1000 para dissociar os EBs em cada poço, pipetando suavemente para cima e para baixo no máximo 10 vezes. Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão de lavagem por poço de EBs dissociados. Colete as células em um tubo de centrífuga de 50 mililitros, passando-as através de um filtro de 40 mícrons.
Depois de contar as células na suspensão filtrada, gire as células para baixo por 10 minutos a 300g. Ressuspenda as células em 300 microlitros de tampão de lavagem pipetando suavemente algumas vezes, garantindo que não haja aglomerações. Prossiga para isolar as células CD34-positivas usando um kit de microesferas CD34 de acordo com as instruções do fabricante.
EBs de boa qualidade mostraram uma borda definida no segundo dia da diferenciação e mostraram-se claras e brilhantes quando observadas ao microscópio. A presença de áreas mais escuras indicou morte celular dentro das EBs. Após o tratamento com quíron com concentrações variáveis no segundo dia, a quantificação do número de células CD34-positivas no oitavo dia de diferenciação revelou a resposta da linhagem celular ao tratamento.
A citometria de fluxo mostrou que o enriquecimento CD34-positivo usando as esferas magnéticas forneceu cerca de 85% de células CD34-positivas.
