للبدء ، ضع جهاز micro sim المجمع في مشابك خرطوم معقمة. ثقافة الجهاز في طبق بتري معقم كبير. لمزيد من الرطوبة ، ضع غطاء أنبوب مخروطي 50 ملليلتر مملوء بالماء المعقم.
لتحضير الجهاز لزراعة الخلايا ، اشطف الغرفة العلوية ب 100 ميكرولتر من الماء. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول طلاء عن طريق خلط الكولاجين أربعة ، الفبرونيكتين البقري والماء المعقم. أخرج الماء من الغرفة العلوية وأضف 100 ميكرولتر من محلول الطلاء.
احتضان الغرفة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. بعد الحضانة ، استبدل محلول الطلاء في الغرفة العلوية ب 100 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة HECSR. أضف 20 ميكرولترا من محلول HECSR في الغرفة السفلية.
للمرور ، EECM-BMEC مثل الخلايا ، أضف خليط إنزيم انفصال الخلية إلى الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى ثماني دقائق. بعد ذلك ، ماصة تعليق الخلية وإضافته إلى أربعة أضعاف حجم الوسط البطاني في أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 200G لمدة خمس دقائق وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من HECSR.
قم بزرع الخلايا بكثافة 40،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في الغرفة العلوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات لتسهيل التصاق الخلايا. بعد الحضانة ، تبادل الوسيط مع HECSR جديد في كلا المجلسين. ثبت الخلايا بإضافة 20 ميكرولترا من الميثانول بنسبة 100٪ ، مبردة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر في الغرفة السفلية و 50 ميكرولترا في الغرفة العلوية.
احتضان الجهاز في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الخلايا بإضافة 20 ميكرولترا من PBS إلى الغرفة السفلية و 100 ميكرولتر في الغرفة العلوية. بعد كل غسل ، تأكد من عدم وجود فقاعات في الغرفة السفلية.
قم بسد الخلايا لمدة 30 دقيقة عن طريق إضافة 20 ميكرولترا من محلول الحجب في الغرفة السفلية و 50 ميكرولترا في الغرفة العلوية. بعد الحجب ، استبدل الحجم في الغرفة العلوية ب 50 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الأساسي واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل PBS ، أضف 50 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الثانوي في الغرفة العلوية واحتضانها لمدة ساعة محمية من الضوء.
بعد غسل PBS ، أضف 50 ميكرولترا من Hoechst إلى الغرفة العلوية واحتضانها لمدة ثلاث دقائق. ثم أضف 20 ميكرولترا من PBS إلى الغرفة السفلية و 100 ميكرولتر إلى الغرفة العلوية. تخيل الجهاز على الفور على مجهر متحد البؤر.
حدد موقع نافذة الغشاء باستخدام هدف 40x لمسافة العمل الطويلة الرطبة وانتقل إلى قنوات مضان للتحقق من تلطيخ Hoechst والتقاطع. يتم عرض كثافات الجلوس المثلى لزراعة خلايا HIPSC و BPLC تحت البذور هنا. كان من الأسهل التمييز بين الاستزراع المشترك المشتق من HIPSC في تصوير تباين الطور مقارنة بالثقافات المشتركة الأولية.
يؤدي انخفاض بذر BPLC إلى ضعف تغطية الطفيليات والتكتل بينما يؤدي الإفراط في تناول الطعام إلى تقشير طبقة الطفيلي من الغشاء. في الثقافة المشتركة للخلايا المشتقة من HIPSC الملطخة بالمناعة ، شوهدت طبقتان من الخلايا على مقربة ، مفصولة فقط بغشاء نانوي رقيق من نيتريد السيليكون. في مقايسة النفاذية ، يشير التباين العالي في نفاذية الخلايا البطانية المزروعة لمدة يومين إلى أن يومين من الثقافة لم يكونا كافيين لنضوج الحاجز.
علاوة على ذلك ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في النفاذية بين المختبرات عند نضج الحاجز من أربعة أيام فصاعدا.