Til at begynde med skal du placere den samlede mikro-sim-enhed i sterile slangeklemmer. Dyrk enheden i en stor steril petriskål. For ekstra fugtighed skal du placere et 50 ml konisk rørlåg fyldt med sterilt vand.
For at forberede enheden til celledyrkning skylles det øverste kammer med 100 mikroliter vand. Forbered derefter en belægningsopløsning ved at blande kollagen fire, bovin fibronectin og sterilt vand. Fjern vandet fra det øverste kammer og tilsæt 100 mikroliter belægningsopløsning.
Inkuber kammeret ved 37 grader Celsius i to til fire timer. Efter inkubation udskiftes belægningsopløsningen i topkammeret med 100 mikroliter stuetemperatur HECSR. Tilsæt 20 mikroliter HECSR-opløsning i bundkammeret.
For at passere, EECM-BMEC-lignende celler, tilsættes en celleløsrevelsesenzymblanding til cellerne og inkuberes ved 37 grader Celsius i fem til otte minutter. Derefter pipetteres cellesuspensionen og tilsættes til fire gange volumenet af endotelmediet i et centrifugerør. Centrifuger ved 200G i fem minutter og genopslæm cellerne i en milliliter HECSR.
Frø cellerne med en tæthed på 40.000 celler pr. Kvadratcentimeter i det øverste kammer og inkuber ved 37 grader Celsius i to til fire timer for at lette celleadhæsion. Efter inkubation udveksles mediet med frisk HECSR i begge kamre. Fastgør cellerne ved at tilføje 20 mikroliter 100% methanol, kølet ved minus 20 grader Celsius i det nederste kammer og 50 mikroliter i det øverste kammer.
Inkuber enheden ved stuetemperatur i to til 10 minutter. Vask derefter cellerne ved at tilsætte 20 mikroliter PBS i bundkammeret og 100 mikroliter i det øverste kammer. Efter hver vask skal du bekræfte manglen på bobler i bundkammeret.
Bloker cellerne i 30 minutter ved at tilsætte 20 mikroliter af blokeringsopløsningen i bundkammeret og 50 mikroliter i det øverste kammer. Efter blokering udskiftes volumenet i det øverste kammer med 50 mikroliter af den primære antistofopløsning og inkuberes i en time ved stuetemperatur. Efter PBS-vask tilsættes 50 mikroliter sekundær antistofopløsning i det øverste kammer og inkuberes i en time beskyttet mod lys.
Efter PBS-vask tilsættes 50 mikroliter Hoechst til topkammeret og inkuberes i tre minutter. Derefter tilsættes 20 mikroliter PBS til bundkammeret og 100 mikroliter til det øverste kammer. Billede enheden straks på et konfokalmikroskop.
Membranvinduet lokaliseres med en våd 40x målsætning med lang arbejdsafstand, og skift til fluorescenskanaler for at kontrollere Hoechst- og forbindelsesfarvning. Optimale siddetætheder for HIPSC-cellekultur og BPLC under frø demonstreres her. Den HIPSC-afledte cokultur var lettere at skelne i fasekontrastbilleddannelse end primære cokulturer.
Lav BPLC-såning resulterer i dårlig parasitdækning og klumpning, mens overspisning fører til, at parasitlaget skræller membranen af. I immunfarvet HIPSC-afledt cellecokultur blev to lag celler set i umiddelbar nærhed, kun adskilt af en tynd siliciumnitridnanomembran. I permeabilitetsanalysen indikerer høj variabilitet i permeabiliteten af endotelcellerne dyrket i to dage, at to dages dyrkning var utilstrækkelig til barrieremodning.
Desuden var der ingen signifikante forskelle i permeabilitet mellem laboratorierne ved barrieremodning fra fire dage på.