Plaats om te beginnen het gemonteerde micro-sim-apparaat in steriele slangklemmen. Kweek het apparaat in een grote steriele petrischaal. Plaats voor extra vochtigheid een conisch buisdeksel van 50 milliliter gevuld met steriel water.
Om het apparaat voor te bereiden op celkweek, spoelt u de bovenste kamer met 100 microliter water. Bereid vervolgens een coatingoplossing voor door collageen vier, runderfibronectine en steriel water te mengen. Verwijder het water uit de bovenste kamer en voeg 100 microliter coatingoplossing toe.
Incubeer de kamer bij 37 graden Celsius gedurende twee tot vier uur. Vervang na incubatie de coatingoplossing in de bovenste kamer door 100 microliter HECSR op kamertemperatuur. Voeg 20 microliter HECSR-oplossing toe aan de onderste kamer.
Om te passeren, voegen EECM-BMEC-achtige cellen een enzymmengsel voor celafgifte toe aan de cellen en incuberen ze gedurende vijf tot acht minuten bij 37 graden Celsius. Pipeteer vervolgens de celsuspensie en voeg deze toe aan vier keer het volume van het endotheelmedium in een centrifugebuis. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 200 G en suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter HECSR.
Zaai de cellen met een dichtheid van 40.000 cellen per vierkante centimeter in de bovenste kamer en incubeer ze twee tot vier uur bij 37 graden Celsius om de celhechting te vergemakkelijken. Vervang het medium na incubatie door verse HECSR in beide kamers. Fixeer de cellen door 20 microliter 100% methanol, gekoeld bij min 20 graden Celsius toe te voegen aan de onderste kamer en 50 microliter aan de bovenste kamer.
Incubeer het apparaat gedurende twee tot 10 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de cellen door 20 microliter PBS toe te voegen aan de onderste kamer en 100 microliter aan de bovenste kamer. Controleer na elke wasbeurt of er geen luchtbellen in de onderste kamer zijn.
Blokkeer de cellen gedurende 30 minuten door 20 microliter van de blokkerende oplossing toe te voegen aan de onderste kamer en 50 microliter aan de bovenste kamer. Vervang na het blokkeren het volume in de bovenste kamer door 50 microliter van de primaire antilichaamoplossing en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Voeg na het wassen van PBS 50 microliter van de secundaire antilichaamoplossing toe aan de bovenste kamer en incubeer gedurende een uur beschermd tegen licht.
Voeg na het wassen van PBS 50 microliter Hoechst toe aan de bovenste kamer en incubeer gedurende drie minuten. Voeg vervolgens 20 microliter PBS toe aan de onderste kamer en 100 microliter aan de bovenste kamer. Breng het apparaat onmiddellijk in beeld op een confocale microscoop.
Lokaliseer het membraanvenster met behulp van een nat 40x objectief met lange werkafstand en schakel over naar fluorescentiekanalen om de kleuring van Hoechst en junctie te controleren. Optimale zitdichtheden voor HIPSC-celkweek en onderzaad BPLC worden hier gedemonstreerd. De van HIPSC afgeleide co-cultuur was gemakkelijker te onderscheiden in fasecontrastbeeldvorming dan primaire co-culturen.
Lage BPLC-zaaiing resulteert in een slechte parasietendekking en klontering, terwijl te veel eten ertoe leidt dat de parasietlaag van het membraan afbladdert. In immunogekleurde HIPSC-afgeleide celco-cultuur werden twee lagen cellen dicht bij elkaar gezien, alleen gescheiden door een dun siliciumnitride nanomembraan. In de permeabiliteitstest geeft de hoge variabiliteit in de permeabiliteit van de endotheelcellen die gedurende twee dagen werden gekweekt, aan dat twee dagen kweek onvoldoende was voor barrièrerijping.
Verder waren er geen significante verschillen in permeabiliteit tussen de laboratoria bij barrièrerijping vanaf vier dagen.