Legen Sie zunächst das zusammengebaute Micro-SIM-Gerät in sterile Schlauchschellen. Kultivieren Sie das Gerät in einer großen sterilen Petrischale. Für zusätzliche Luftfeuchtigkeit setzen Sie einen konischen 50-Milliliter-Röhrchendeckel auf, der mit sterilem Wasser gefüllt ist.
Um das Gerät für die Zellkultivierung vorzubereiten, spülen Sie die obere Kammer mit 100 Mikrolitern Wasser ab. Als nächstes bereiten Sie eine Beschichtungslösung vor, indem Sie Kollagen vier, Rinderfibronektin und steriles Wasser mischen. Entfernen Sie das Wasser aus der oberen Kammer und fügen Sie 100 Mikroliter Beschichtungslösung hinzu.
Inkubieren Sie die Kammer bei 37 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden. Ersetzen Sie nach der Inkubation die Beschichtungslösung in der oberen Kammer durch 100 Mikroliter HECSR bei Raumtemperatur. Geben Sie 20 Mikroliter HECSR-Lösung in die untere Kammer.
Zur Passage geben EECM-BMEC-ähnliche Zellen eine Enzymmischung aus Zellablösung in die Zellen und inkubieren sie fünf bis acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes wird die Zellsuspension pipettiert und in einem Zentrifugenröhrchen auf das vierfache Volumen des Endothelmediums gegeben. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 G und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter HECSR.
Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen pro Quadratzentimeter in der oberen Kammer aus und inkubieren Sie sie zwei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Zelladhäsion zu erleichtern. Nach der Inkubation tauschen Sie das Medium in beiden Kammern gegen frisches HECSR aus. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 20 Mikroliter 100%iges Methanol, gekühlt bei minus 20 Grad Celsius in die untere Kammer und 50 Mikroliter in die obere Kammer geben.
Inkubieren Sie das Gerät zwei bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Zellen, indem Sie 20 Mikroliter PBS in die untere Kammer und 100 Mikroliter in die obere Kammer geben. Vergewissern Sie sich nach jeder Wäsche, dass sich in der unteren Kammer keine Blasen bilden.
Blockieren Sie die Zellen für 30 Minuten, indem Sie 20 Mikroliter der Blockierungslösung in die untere Kammer und 50 Mikroliter in die obere Kammer geben. Nach dem Blockieren wird das Volumen in der oberen Kammer durch 50 Mikroliter der primären Antikörperlösung ersetzt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem PBS-Waschen 50 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung in die obere Kammer geben und eine Stunde lang lichtgeschützt inkubieren.
Nach dem PBS-Waschen 50 Mikroliter Hoechst in die obere Kammer geben und drei Minuten lang inkubieren. Geben Sie dann 20 Mikroliter PBS in die untere Kammer und 100 Mikroliter in die obere Kammer. Fotografieren Sie das Gerät sofort mit einem konfokalen Mikroskop.
Lokalisieren Sie das Membranfenster mit einem 40-fachen Objektiv mit feuchtem Arbeitsabstand und wechseln Sie zu Fluoreszenzkanälen, um die Hoechst- und Diaphragmaturfärbung zu überprüfen. Hier werden optimale Sitzdichten für HIPSC-Zellkulturen und Underseed-BPLC demonstriert. Die von HIPSC abgeleitete Kokultur war in der Phasenkontrastbildgebung leichter zu unterscheiden als primäre Kokulturen.
Eine niedrige BPLC-Aussaat führt zu einer schlechten Parasitenabdeckung und Verklumpung, während übermäßiges Essen dazu führt, dass sich die Parasitenschicht von der Membran ablöst. In immungefärbten HIPSC-abgeleiteten Zell-Kokulturen waren zwei Zellschichten in unmittelbarer Nähe zu sehen, die nur durch eine dünne Siliziumnitrid-Nanomembran getrennt waren. Im Permeabilitätsassay deutet eine hohe Variabilität in der Permeabilität der zwei Tage lang kultivierten Endothelzellen darauf hin, dass zwei Tage Kultur für die Barrierereifung nicht ausreichten.
Darüber hinaus gab es keine signifikanten Unterschiede in der Permeabilität zwischen den Laboren bei der Barrierereifung ab vier Tagen.