शुरू करने के लिए, इकट्ठे माइक्रो सिम डिवाइस को बाँझ नली क्लैंप में रखें। डिवाइस को एक बड़े बाँझ पेट्री डिश में कल्चर करें। अतिरिक्त आर्द्रता के लिए, बाँझ पानी से भरा 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ढक्कन रखें।
सेल संवर्धन के लिए डिवाइस तैयार करने के लिए, शीर्ष कक्ष को 100 माइक्रोलीटर पानी से कुल्ला करें। इसके बाद, कोलेजन चार, गोजातीय फाइब्रोनेक्टिन और बाँझ पानी को मिलाकर एक कोटिंग समाधान तैयार करें। शीर्ष कक्ष से पानी निकालें और 100 माइक्रोलीटर कोटिंग समाधान जोड़ें।
कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस पर दो से चार घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, शीर्ष कक्ष में कोटिंग समाधान को 100 माइक्रोलीटर कमरे के तापमान एचईसीएसआर के साथ बदलें। नीचे कक्ष में 20 माइक्रोलीटर एचईसीएसआर समाधान जोड़ें।
पारित करने के लिए, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं, कोशिकाओं में एक सेल डिटेचमेंट एंजाइम मिश्रण जोड़ें और पांच से आठ मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, सेल निलंबन को पिपेट करें और इसे सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एंडोथेलियल माध्यम की मात्रा के चार गुना तक जोड़ें। पांच मिनट के लिए 200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और एचईसीएसआर के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
शीर्ष कक्ष में 40,000 कोशिकाओं प्रति वर्ग सेंटीमीटर के घनत्व पर कोशिकाओं को बीज दें और सेल आसंजन की सुविधा के लिए दो से चार घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, दोनों कक्षों में ताजा एचईसीएसआर के साथ माध्यम का आदान-प्रदान करें। 100% मेथनॉल के 20 माइक्रोलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें, नीचे के कक्ष में शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस और शीर्ष कक्ष में 50 माइक्रोलीटर पर ठंडा करें।
डिवाइस को कमरे के तापमान पर दो से 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, निचले कक्ष में पीबीएस के 20 माइक्रोलीटर और शीर्ष कक्ष में 100 माइक्रोलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। प्रत्येक धोने के बाद, निचले कक्ष में बुलबुले की कमी की पुष्टि करें।
निचले कक्ष में 20 माइक्रोलीटर ब्लॉकिंग समाधान और शीर्ष कक्ष में 50 माइक्रोलीटर जोड़कर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को अवरुद्ध करें। अवरुद्ध करने के बाद, शीर्ष कक्ष में मात्रा को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 50 माइक्रोलीटर के साथ बदलें और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस धोने के बाद, शीर्ष कक्ष में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रकाश से सुरक्षित एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
पीबीएस धोने के बाद, शीर्ष कक्ष में 50 माइक्रोलीटर होचस्ट जोड़ें और तीन मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर नीचे के कक्ष में पीबीएस के 20 माइक्रोलीटर और शीर्ष कक्ष में 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। डिवाइस को तुरंत एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर चित्रित करें।
गीली लंबी कामकाजी दूरी 40x उद्देश्य का उपयोग करके झिल्ली खिड़की का पता लगाएं और होचस्ट और जंक्शन धुंधलापन की जांच करने के लिए प्रतिदीप्ति चैनलों पर स्विच करें। एचआईपीएससी सेल कल्चर और अंडरसीड बीपीएलसी के लिए इष्टतम बैठने की घनत्व यहां प्रदर्शित की गई है। एचआईपीएससी व्युत्पन्न सह-संस्कृति प्राथमिक सह-संस्कृतियों की तुलना में चरण कंट्रास्ट इमेजिंग में अंतर करना आसान था।
कम बीपीएलसी सीडिंग के परिणामस्वरूप परजीवी कवरेज खराब होता है और अधिक खाने के दौरान क्लंपिंग से परजीवी परत झिल्ली से छील जाती है। इम्यूनोस्टेन्ड एचआईपीएससी व्युत्पन्न सेल सह-संस्कृति में, कोशिकाओं की दो परतों को निकटता में देखा गया था, जो केवल एक पतली सिलिकॉन नाइट्राइड नैनोमेम्ब्रेन द्वारा अलग किया गया था। पारगम्यता परख में, दो दिनों के लिए संवर्धित एंडोथेलियल कोशिकाओं की पारगम्यता में उच्च परिवर्तनशीलता इंगित करती है कि दो दिनों की संस्कृति बाधा परिपक्वता के लिए अपर्याप्त थी।
इसके अलावा, चार दिनों से बाधा परिपक्वता पर प्रयोगशालाओं के बीच पारगम्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।