시작하려면 조립된 마이크로 SIM 장치를 멸균 호스 클램프에 넣습니다. 큰 멸균 페트리 접시에서 장치를 배양합니다. 습도를 높이려면 멸균수를 채운 50밀리리터 원뿔형 튜브 뚜껑을 놓습니다.
세포 배양을 위해 장치를 준비하려면 상단 챔버를 100마이크로리터의 물로 헹굽니다. 다음으로, 콜라겐 4, 소 피브로넥틴 및 멸균수를 혼합하여 코팅 용액을 준비합니다. 상단 챔버에서 물을 제거하고 100 마이크로 리터의 코팅 용액을 추가합니다.
챔버를 섭씨 37도에서 2-4시간 동안 배양합니다. 배양 후 상단 챔버의 코팅 용액을 100 마이크로 리터의 실온 HECSR로 교체합니다. 하단 챔버에 20마이크로리터의 HECSR 용액을 추가합니다.
통과에, EECM-BMEC 세포와 같이, 세포에 세포 분리 효소 혼합물을 추가하고 5 8 분 동안 37 섭씨 온도에 배양하십시오. 다음으로, 세포 현탁액을 피펫팅하고 원심분리 튜브에 내피 배지 부피의 4배까지 추가합니다. 200G에서 5분 동안 원심분리하고 1밀리리터의 HECSR에 세포를 다시 부유시킵니다.
40의 조밀도에 세포를 최고 약실에 있는 평방 센티미터 당 000의 세포를 씨를 뿌리고 세포 접착을 촉진하기 위하여 2 4 시간 동안 37 섭씨 온도에 부화한다. 배양 후 두 챔버에서 배지를 신선한 HECSR로 교환합니다. 섭씨 영하 20도에서 냉각된 100% 메탄올 20마이크로리터를 하단 챔버에 넣고 상단 챔버에 50마이크로리터를 추가하여 셀을 고정합니다.
장치를 실온에서 2-10분 동안 배양합니다. 다음으로, 하단 챔버에 20 마이크로 리터의 PBS를 추가하고 상단 챔버에 100 마이크로 리터를 추가하여 셀을 세척합니다. 세탁 후 바닥 챔버에 기포가 없는지 확인하십시오.
차단 용액 20마이크로리터를 하단 챔버에 추가하고 상단 챔버에 50마이크로리터를 추가하여 30분 동안 세포를 차단합니다. 차단 후 상단 챔버의 부피를 50 마이크로 리터의 1 차 항체 용액으로 교체하고 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. PBS 세척 후 50 마이크로리터의 2차 항체 용액을 상단 챔버에 넣고 빛으로부터 보호된 상태에서 1시간 동안 배양합니다.
PBS 세척 후 50 마이크로 리터의 Hoechst를 상단 챔버에 넣고 3 분 동안 배양합니다. 그런 다음 하단 챔버에 20마이크로리터의 PBS를 추가하고 상단 챔버에 100마이크로리터를 추가합니다. 컨포칼 현미경으로 즉시 장치를 이미지화합니다.
습식 긴 작동 거리 40x 대물렌즈를 사용하여 멤브레인 창을 찾고 형광 채널로 전환하여 Hoechst 및 접합부 염색을 확인합니다. HIPSC 세포 배양 및 언더시드 BPLC를 위한 최적의 시트 밀도가 여기에서 입증되었습니다. HIPSC 유래 공동 배양은 1차 공동 배양보다 위상차 이미징에서 구별하기가 더 쉬웠습니다.
낮은 BPLC 파종은 기생충 커버리지를 떨어뜨리고 과식하는 동안 뭉치면 기생충 층이 막에서 벗겨집니다. 면역염색된 HIPSC 유래 세포 공동 배양에서 두 층의 세포가 근접하여 관찰되었으며, 얇은 질화규소 나노막에 의해서만 분리되었습니다. 투과성 분석에서, 2일 동안 배양한 내피 세포의 투과성의 높은 변동성은 2일간의 배양이 장벽 성숙에 불충분했음을 나타냅니다.
또한, 4일 후부터 장벽 성숙 시 실험실 간에 투과성에 유의한 차이가 없었습니다.