Till att börja med, placera den monterade mikro-sim-enheten i steril slang clamps. Odla enheten i en stor steril petriskål. För extra luftfuktighet, placera ett 50 ml koniskt rörlock fyllt med sterilt vatten.
För att förbereda enheten för cellodling, skölj den övre kammaren med 100 mikroliter vatten. Förbered sedan en beläggningslösning genom att blanda kollagen fyra, bovint fibronektin och sterilt vatten. Ta bort vattnet från den övre kammaren och tillsätt 100 mikroliter beläggningslösning.
Inkubera kammaren vid 37 grader Celsius i två till fyra timmar. Efter inkubation, byt ut beläggningslösningen i den övre kammaren mot 100 mikroliter rumstemperatur HECSR. Tillsätt 20 mikroliter HECSR-lösning i bottenkammaren.
För att passera, EECM-BMEC-liknande celler, tillsätt en cellavskiljande enzymblandning till cellerna och inkubera vid 37 grader Celsius i fem till åtta minuter. Pipettera sedan cellsuspensionen och tillsätt den till fyra gånger endotelmediets volym i ett centrifugrör. Centrifugera vid 200 G i fem minuter och suspendera cellerna i en milliliter HECSR.
Sådd av cellerna med en densitet av 40 000 celler per kvadratcentimeter i den övre kammaren och inkubera vid 37 grader Celsius i två till fyra timmar för att underlätta cellvidhäftning. Efter inkubationen byts mediet ut mot färsk HECSR i båda kamrarna. Fixera cellerna genom att tillsätta 20 mikroliter 100 % metanol, kyld vid minus 20 grader Celsius i den nedre kammaren och 50 mikroliter i den övre kammaren.
Inkubera enheten i rumstemperatur i två till 10 minuter. Tvätta sedan cellerna genom att tillsätta 20 mikroliter PBS i den nedre kammaren och 100 mikroliter i den övre kammaren. Efter varje tvätt, bekräfta att det inte finns några bubblor i bottenkammaren.
Blockera cellerna i 30 minuter genom att tillsätta 20 mikroliter av den blockerande lösningen i den nedre kammaren och 50 mikroliter i den övre kammaren. Efter blockering ersätts volymen i den övre kammaren med 50 mikroliter av den primära antikroppslösningen och inkuberas i en timme vid rumstemperatur. Efter PBS-tvätt, tillsätt 50 mikroliter av den sekundära antikroppslösningen i den övre kammaren och inkubera i en timme skyddad från ljus.
Efter PBS-tvätt, tillsätt 50 mikroliter Hoechst i den övre kammaren och inkubera i tre minuter. Tillsätt sedan 20 mikroliter PBS till den nedre kammaren och 100 mikroliter till den övre kammaren. Avbilda enheten omedelbart i ett konfokalmikroskop.
Lokalisera membranfönstret med ett vått långt arbetsavstånd 40x objektiv och byt till fluorescenskanaler för att kontrollera Hoechst och korsningsfärgning. Optimala sitttätheter för HIPSC-cellodling och BPLC under frö demonstreras här. Den HIPSC-härledda samkulturen var lättare att urskilja i faskontrastavbildning än primära samkulturer.
Låg BPLC-sådd resulterar i dålig parasittäckning och klumpar ihop sig medan överätning leder till att parasitskiktet skalar av membranet. I immunostained HIPSC-härledd cellsamkultur sågs två lager av celler i närheten av varandra, endast åtskilda av ett tunt nanomembran av kiselnitrid. I permeabilitetstestet indikerar hög variabilitet i permeabiliteten hos endotelcellerna som odlats under två dagar att två dagars odling var otillräcklig för barriärmognad.
Vidare fanns det inga signifikanta skillnader i permeabilitet mellan laboratorierna vid barriärmognad från fyra dagar och framåt.
