Comience diluyendo 0,5 microlitros de los cultivos nocturnos de cultivo de Agrobacterium tumefaciens con 50 mililitros de agua ultrapura esterilizada en autoclave. Extienda 10 microlitros de este cultivo diluido en un caldo de lisogenia o en un plato de LB. Incubar la placa a una temperatura de 28 a 30 grados centígrados durante uno a tres días.
Ahora, inocule una sola colonia en 20 mililitros de medios LB suplementados con rifampicina. Incubar el cultivo durante la noche a una temperatura de 28 a 30 grados centígrados. Al día siguiente, inocule 500 mililitros de medio LB simple en un matraz mezclador con nueve mililitros de cultivo durante la noche.
Coloque los cultivos en una coctelera a 28 a 30 grados centígrados. Después de la incubación y la división de los cultivos en tubos, centrifugar los tubos refrigerados a cuatro grados centígrados y 4.000 g durante 15 minutos. Con una pipeta, retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo en 50 mililitros de agua helada.
Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en 25 mililitros de agua helada en cada tubo. Centrifugar como antes, luego resuspender el gránulo en un mililitro de glicerol al 10% helado. Ahora, combine el contenido de todos los tubos en un solo tubo de 50 mililitros antes de centrifugar.
Finalmente, después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en 400 microlitros de glicerol helado.