Los autores desean agradecer al Prof. Paul Hooykaas por proporcionar amablemente el vector pCAMBIA1302 y Agrobacterium tumefaciens AGL1 del Instituto de Biología de Leiden, Universidad de Leiden, Países Bajos. Los autores también quieren agradecer a Eva Colic por su ayuda en el cultivo de los transformadores fluorescentes. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y el programa Mitacs Accelerate.

Todos los medios y soluciones deben esterilizarse en autoclave antes de su uso, a menos que se indique lo contrario. Todos los tubos de centrífuga, puntas de pipeta, etc., deben ser estériles o esterilizados en autoclave antes de su uso. Para facilitar la referencia, las recetas de medios utilizadas en este protocolo se enumeran en la Tabla 1.
1. Preparación de células electrocompetentes de A. tumefaciens 
<ol><li>Inocular Agrobacterium (AGL-1) en un matraz agitador estéril de 25 ml de medios LB (suplementado con rifampicina, 20 mg/L-1) a partir de una reserva de glicerol congelada y crecer durante la noche a 28-30 °C y 150 rpm. NOTA: La cepa AGL-1 de Agrobacterium es (ver Tabla de Materiales) resistente a la rifampicina, ampicilina, cloranfenicol y estreptomicina y se puede obtener de varios proveedores.</li>
	<li>Al día siguiente, diluir el cultivo 1,00,000 veces agregando 0,5 μL del cultivo durante la noche a 50 ml de agua ultrapura esterilizada en autoclave y esparcir 10 μL de este cultivo diluido en una placa LB, y luego incubar a 28-30 °C durante 1-3 días.</li>
	<li>Elegir una colonia e iniciar un cultivo nocturno de 20 mL en LB con rifampicina a 28-30 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, inocular 500 mL de medio LB (sin antibiótico) en un matraz agitador con 9 mL del cultivo nocturno y crecer a 28-30 °C hasta que el DO600 alcance 0,5.</li>
	<li>Divida el cultivo uniformemente en diez tubos de centrífuga de 50 ml y enfríe en hielo durante 30 minutos. Enfriar previamente la centrífuga a 4 °C.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 4 °C y 4000 x g durante 15 min. Posteriormente, retire la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el gránulo en cada tubo en 50 ml de agua helada.</li>
	<li>Centrifugar las células a 4 °C y 4000 x g durante 15 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml de agua helada en cada tubo.</li>
	<li>Centrifugar las células a 4 °C y 4000 x g durante 15 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de glicerol helado al 10% (p/v) en cada tubo.</li>
	<li>Combine todos los tubos en un tubo de 50 ml y centrifugue las células a 4 °C y 4000 x g durante 15 min. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 400 μL de glicerol al 10% (p/v) helado. La concentración celular debe ser de aproximadamente 1-3 x 1010 células/mL.</li>
	<li>Distribuya las células como alícuotas de 50 μL en microtubos estériles preenfriados. Congelar en nitrógeno líquido y conservar en un congelador a -80 °C.</li>
</ol>2. Electroporación de A. tumefaciens
<ol><li>Añadir 50 μL de células electrocompetentes AGL-1 A. tumefaciens en una cubeta preenfriada de 0,1 mm y añadir 2 μL de pCAMBIA1302 o plásmido similar (conc 15 ng/μL) (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Electroporar a 2400 V usando un electroporador (200 Ω, extensor de capacitancia 250 μFD, capacitancia 25 μFD, decaimiento exponencial, ver Tabla de Materiales). La constante de tiempo debe ser de >4,5 ms para una electroporación exitosa con decaimiento exponencial.</li>
	<li>Agregue inmediatamente 1 ml de medio LB a la cubeta y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Transfiera 1 ml de células resuspendidas a un microtubo de 1,5 ml e incube a 28-30 °C durante al menos 1 h para recuperarse.</li>
	<li>Coloque las células en agar LB que contenga el antibiótico apropiado (es decir, 50 mg/L de kanamicina para pCAMBIA1302 para la selección procariota).</li>
	<li>Incubar a 28-30 °C durante 2-3 días.</li>
	<li>Seleccione una colonia, cultive durante la noche en LB con la selección adecuada (50 mg/L de kanamicina para pCAMBIA1302) y criopreserva la cepa que contiene plásmidos utilizando glicerol al 50% a -80 °C para su uso futuro.</li>
</ol>3. AMT de C. vulgaris
NOTA: Prepare los cultivos de C. vulgaris (UTEX 395, ver Tabla de Materiales) y A. tumefaciens en paralelo para el co-cultivo. Los cultivos de C. vulgarideben iniciarse 3 días antes de preparar los cultivos de A. tumefaciens. El protocolo fue modificado con base en lo publicado por Kumar et al.7.
<ol><li>Preparar el cultivo de C. vulgaris <ol><li>C. vulgaris se almacena tradicionalmente en oblicuas o se mantiene en cultivos de fase logarítmica en condiciones de iluminación. A partir de un cultivo en fase logarítmica a DO600 = 1,0, extender 0,5 mL sobre una placa de agar de acetato de tris-fosfato (TAP, ver Tabla 1) ( 1,2% p/v agar A) y crecer durante 5 días a 25 °C con iluminación (50 μE/m2s). Esto producirá aproximadamente 5 x 106 celdas.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar el cultivo de A. tumefaciens <ol><li>Cultive la cepa de A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 en un matraz agitador inoculando 10 mL de medio LB suplementado con 15 mM de glucosa, 20 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de kanamicina (ver Tabla de Materiales) utilizando el caldo de glicerol. Incubar a 28-30 °C y 250 rpm durante la noche.</li>
		<li>Inocular 1 mL de cultivo durante la noche en 50 mL de LB con 15 mM de glucosa, 20 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de kanamicina e incubar a 28-30 °C y 250 rpm hasta que el OD600 alcance 1,0.</li>
	</ol></li>
	<li>Cocultivar C. vulgaris y A. tumefaciens
	<ol><li>Para preparar el cultivo de A. tumefaciens para el cocultivo, transfiera el cultivo cultivado a un tubo de 50 ml y centrifugue a 4000 x g durante 30 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante con una pipeta y lave las células dos veces con el medio de inducción. NOTA: El medio de inducción utilizado es un medio TAP ajustado a pH 5,5 y suplementado con metales traza medios F/2 y vitaminas con 200 μM de acetosiringona (AS, ver Tabla de Materiales). Vuelva a suspender las células en medios de inducción de modo que OD600 = 0,5.</li>
		<li>Para preparar el cultivo de C. vulgaris para el cocultivo, agregue 25 mL de medio de inducción a la placa de C. vulgaris que contiene ~ 5 x 106 células. Transfiera a un tubo de 50 ml. Centrifugar las células a 4000 x g durante 15 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Mezclar el gránulo de células de algas con 200 μL de la suspensión bacteriana (OD600: 0,5) e incubarlos en un agitador rotativo a 21-25 °C a 150 rpm durante 1 h.</li>
		<li>Extender el cultivo mixto (200 μL) en placas de inducción suplementadas con 15 mM de glucosa e incubar a 21-25 °C en la oscuridad durante 3 días.</li>
		<li>Después de 3 días, use 10 mL de medio TAP suplementado con 400 mg/L de cefotaxima o 20 mg/L de tetraciclina (ver Tabla de Materiales) para recolectar las microalgas e incubar en la oscuridad a 21-25 °C durante 2 días para eliminar A. tumefaciens del cultivo.</li>
		<li>Colocar 500 μL del cultivo en un medio selectivo, p. ej., medio TAP suplementado con 20-70 mg/L de higromicina B (cuando se utiliza pCAMBIA1302) y 400 mg/L-1 de cefotaxima o 20 mg/L de tetraciclina. Incubar a 21-25 °C en la oscuridad durante 2 días antes de colocarlos en una cámara iluminada. NOTA: Las colonias resistentes aparecerán de 5 a 7 días después de la exposición a la luz.</li>
		<li>Recoger colonias individuales de la placa de transformación y volver a enrasarlas en placas de agar TAP suplementadas con 400 mg/L de cefotaxima o 20 mg/L de tetraciclina y 20-70 mg/L de higromicina B.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PCR de colonias (cPCR) para confirmar la integración génica en transformantes de C. vulgaris 
<ol><li>Extraer ADN genómico de un transformante de C. vulgaris después de subcultivar al menos dos veces de una sola colonia utilizando un kit de extracción de ADN genómico de plantas (ver Tabla de Materiales). Usando esto como plantilla para la PCR, diseñe cebadores para la región mgfp5 del ADN-T (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', y M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').<ol><li>Utilizando un kit de mezcla maestra de ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (ver Tabla de materiales), realice la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para validar la integración del transgén. NOTA: Para el presente estudio se utilizaron las siguientes condiciones: 98 °C durante 3 min; 35 ciclos (98 °C durante 10 s, 57 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 min); 72 °C durante 5min. Utilice pCAMBIA1302 como control positivo y ADN genómico de C. vulgaris de tipo salvaje como control negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Para confirmar que no hay pCAMBIA1302 presente en la muestra debido a la contaminación residual por A. tumefaciens, utilice la PCR de colonias. Añadir una pequeña cantidad de células transformantes a 10 μL de agua estéril y hervir a 98 °C durante 15 min. Utilícelo como plantilla para la PCR.<ol><li>Diseñe cebadores para una región fuera del ADN-T en pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' y B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3'). NOTA: Para el presente estudio se utilizaron las siguientes condiciones: 94 °C durante 3 min; 30 ciclos (94 °C durante 30 s, 48 °C durante 30 s, 68 °C durante 5 min); 68 °C durante 7 min. Utilizar una colonia hervida de A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) como control positivo y una colonia hervida de C. vulgaris de tipo silvestre como control negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Para confirmar que no hay contaminación por A. tumerfaciens presente en la muestra, utilice la PCR de colonias. Añadir una pequeña cantidad de células transformantes a 10 μL de agua estéril y hervir a 98 °C durante 15 min. Utilícelo como plantilla para la PCR.<ol><li>Diseño de cebadores para el gen virE2 contenido en el plásmido de virulencia AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' y virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3'). NOTA: Para el presente estudio se utilizaron las siguientes condiciones: 94 °C durante 3 min; 30 ciclos (94 °C durante 30 s, 53 °C durante 30 s, 68 °C durante 3 min); 68 °C durante 7 min. Utilizar una colonia hervida de A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) como control positivo y una colonia hervida de C. vulgaris de tipo silvestre como control negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice muestras de PCR en un gel de agarosa de ADN junto con una escalera (escalera de ADN de 1 Kbp, ver Tabla de Materiales) para confirmar el tamaño de los fragmentos resultantes16.</li>
</ol>5. Medición de la fluorescencia de los transformantes
<ol><li>Inocular cada transformante de un cultivo de mantenimiento en fase logarítmica o de agar TAP en 50 mL de TAP suplementado con 200 mg/L-1 de cefotaxima y 25 mg/L-1 de higromicina B de modo que la DO inicialsea de 600 = 0,1. Inocular un cultivo con C. vulgaris de tipo salvaje y solo 200 mg/L-1 de cefotaxima como control negativo. Incubar a 25 °C a 150 rpm con 150 μmol/m2s de luz fotosintéticamente activa (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Cada 24 h, tome una muestra de 300 μL y mida la absorbancia y fluorescencia (excitación 488 nm, emisión 526 nm) en un lector de placas de 96 pocillos o espectrómetro y fluorómetro UV/Vis (ver Tabla de Materiales). Utilice una placa negra con fondo transparente para mediciones simultáneas.</li>
</ol>6. Extracción de proteína bruta, purificación de proteínas y electroforesis SDS-PAGE
<ol><li>Inocular transformante (#50) de un cultivo de mantenimiento en fase logarítmica en 300 mL de TAP suplementado con 200 mg/L-1 de cefotaxima y 25 mg/L-1 de higromicina B para alcanzar el DO680 = 0,1. Inocular un cultivo con C. vulgaris de tipo salvaje y solo 200 mg/L-1 de cefotaxima como control negativo. Incubar a 25 °C a 150 rpm con 150 μmol/m2s de luz fotosintéticamente activa.</li>
	<li>Extraiga la muestra de proteína bruta de las cepas transformante (#50) y salvaje utilizando un tampón de lisis de 5 ml (véase la Tabla 1), seguido de sonicación durante 4 min.</li>
	<li>Purifique la muestra de proteína cruda con una resina de Ni-NTA a través de columnas de polipropileno de 5 mL (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Liofilizar las muestras de proteínas purificadas de 15 mL y resuspenderlas en tampón de lisis de 1 mL para el análisis SDS-PAGE17.</li>
</ol>

Integración de genes estables en Chlorella vulgaris utilizando Agrobacterium tumefaciens

<ol>
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No se declararon conflictos de interés.

La eficiencia de la transformación está asociada a varios parámetros diferentes. La elección de las cepas de A. tumefaciens utilizadas para AMT es crucial. AGL-1 es una de las cepas más invasivas descubiertas y, por esta razón, se ha utilizado de forma rutinaria en la AMT de las plantas. La suplementación de los medios de inducción con glucosa (15-20 mM) también es importante para la eficiencia de la AMT. Teniendo en cuenta que C. vulgaris puede crecer tanto en condiciones fototróficas como he...

Agrobacterium tumefaciens, una bacteria gramnegativa transmitida por el suelo, posee una capacidad única de transferencia de genes entre reinos, lo que le valió el título de "ingeniero genético natural"1. Esta bacteria puede transferir ADN (ADN-T) de un plásmido inductor de tumores (Plásmido Ti) a las células huésped a través de un sistema de secreción de tipo IV, lo que resulta en la integración y expresión del ADN-T dentro del genoma del huésped 1,2,3,4. En el entorno natural, este proceso conduce a la formación de tumores en las plantas, comúnmente conocida como enfermedad de la agalla de la corona. Sin embargo, Agrobacterium también puede transferir ADN-T a otros organismos, como levaduras, hongos, algas, embriones de erizo de mar e incluso células humanas en condiciones de laboratorio 5,6,7,8.
Aprovechando este sistema natural, la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) permite la integración aleatoria de genes de interés en el genoma nuclear de una célula huésped mediante la modificación de la región de ADN-T del plásmido Ti. Para este propósito, un vector de expresión de plantas AMT ampliamente utilizado es pCAMBIA13029. Los investigadores pueden emplear flujos de trabajo de clonación simples en E. coli antes de transferir el vector deseado a A. tumefaciens para su posterior transferencia al huésped de interés.
Las microalgas verdes son eucariotas que comparten muchas similitudes con las plantas terrestres, pero son muy recalcitrantes a la modificación genética. Sin embargo, la transformación genética desempeña un papel crucial tanto en la investigación fundamental como en la biotecnológica de las microalgas. En varias especies de microalgas, en particular Chlamydomonas reinhardtii, la transformación genética a través de AMT ha introducido con éxito transgenes como la interleucina-2 humana (hIL-2), el dominio de unión al receptor 2 del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2 RBD) y dos péptidos antimicrobianos (AMP)10,11,12,13. Entre ellas, Chlorella vulgaris, una especie de alga verde menos exigente y de rápido crecimiento, tiene un potencial significativo para la producción sostenible de carbohidratos, proteínas, nutracéuticos, pigmentos y otros compuestos de alto valor14. Sin embargo, la falta de herramientas confiables para crear cepas transgénicas de C. vulgaris obstaculiza su progreso comercial. Dado que solo ha habido un número limitado de trabajos publicados que utilizan AMT en C. vulgaris15, y dadas las considerables diferencias entre el cultivo de plantas y microalgas, la optimización del protocolo AMT se vuelve esencial.
En este estudio, los investigadores insertaron la proteína verde fluorescente (mGFP5) aguas abajo del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CamV) y agregaron una etiqueta de histidina para usarla como gen reportero para la expresión de proteínas. Los transformantes se seleccionaron utilizando higromicina B, y después de un subcultivo durante más de veinte generaciones, la transformación se mantuvo estable. El plásmido pCAMBIA1302 empleado en este trabajo se puede adaptar fácilmente para contener cualquier gen de interés. Además, el método y los materiales presentados se pueden ajustar para otras especies de algas verdes con un promotor activo CamV35S, ya que este promotor se utiliza para la selección de higromicina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>DM015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D26665G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas</td>
			<td>Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>89151-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>J90010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorella vulgaris</td>
			<td>University of Texas at Austin Culture Collection of Algae</td>
			<td>Strain: UTEX 395</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8661-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CX2185-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9234-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652662</td>
			<td>Main unit equipped with PC module.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plant Genome Purification Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH3093-2.2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6068103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>K-250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>BAKR2540-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7971-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA&#183;2H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>8993-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>BAKR3764-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7257-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CA80058-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4574-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBExpress Ni Resin</td>
			<td>NewEngland BioLabs</td>
			<td>NEB #S1427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9208-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAMBIA1302</td>
			<td>Leiden University</td>
			<td>Gift from Prof. Paul Hooykaas</td>
			<td>pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 mL)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SunBlaster LED Strip Light 48 Inch&#160;</td>
			<td>SunBlaster</td>
			<td>210000000906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer&#160;</td>
			<td>BioTEK</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>CAAAJ61714-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>T0181-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>TG217(G211)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12 (cyanocobalamin)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>89151-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>G0961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4382-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens-mediated genetic engineering of green microalgae, chlorella vulgaris

La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) sirve como una herramienta ampliamente empleada para manipular los genomas de las plantas. Sin embargo, A. tumefaciens exhibe la capacidad de transferencia génica a una amplia gama de especies. Numerosas especies de microalgas carecen de métodos bien establecidos para integrar de forma fiable genes de interés en su genoma nuclear. Para aprovechar los beneficios potenciales de la biotecnología de microalgas, es crucial contar con herramientas de manipulación genómica sencillas y eficientes. En este trabajo, se presenta un protocolo de AMT optimizado para la especie de microalga industrial Chlorella vulgaris, utilizando la proteína fluorescente verde reportera (mGFP5) y el marcador de resistencia a antibióticos para la higromicina B. Los mutantes se seleccionan mediante siembra en medios de tris-acetato-fosfato (TAP) que contienen higromicina B y cefotaxima. La expresión de mGFP5 se cuantifica a través de la fluorescencia después de más de diez generaciones de subcultivo, lo que indica la transformación estable del casete de ADN-T. Este protocolo permite la generación confiable de múltiples colonias transgénicas de C. vulgaris en menos de dos semanas, empleando el vector de expresión vegetal pCAMBIA1302 disponible comercialmente.

Agrobacterium tumefaciens, a gram-negative soil-borne bacterium, possesses a unique interkingdom gene transfer ability, earning it the title &#34;natural genetic engineer&#34;1. This bacterium can transfer DNA (T-DNA) from a tumor-inducing plasmid (Ti-Plasmid) into host cells through a Type IV secretion system, resulting in the integration and expression of the T-DNA within the host genome1,2,3,4. In the natural setting, this process leads to tumor formation in plants, commonly known as crown gall disease. However, Agrobacterium can also transfer T-DNA into various other organisms, including yeast, fungi, algae, sea urchin embryos, and even human cells under laboratory conditions5,6,7,8.
Exploiting this natural system, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) enables the random integration of gene(s) of interest into a host cell&#39;s nuclear genome by modifying the T-DNA region of the Ti-plasmid. For this purpose, a widely used AMT plant expression vector is pCAMBIA13029. Researchers can employ simple cloning workflows in E. coli before transferring the desired vector into A. tumefaciens for subsequent transfer to the host of interest.
Green microalgae are eukaryotes that share many similarities with land plants but are highly recalcitrant to genetic modification. However, genetic transformation plays a crucial role in both fundamental and biotechnological research of microalgae. In several microalgae species, particularly Chlamydomonas reinhardtii, genetic transformation via AMT has successfully introduced transgenes such as human interleukin-2 (hIL-2), the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 receptor-binding domain (SARS-CoV-2 RBD), and two antimicrobial peptides (AMPs)10,11,12,13. Among these, Chlorella vulgaris, a less fastidious and fast-growing green algae species, holds significant potential for the sustainable production of carbohydrates, proteins, nutraceuticals, pigments, and other high-value compounds14. However, the lack of reliable tools for creating transgenic strains of C. vulgaris hampers its commercial progress. Since there have been only a limited number of published works utilizing AMT in C. vulgaris15, and given the considerable differences between plant and microalgae cultivation, optimizing the AMT protocol becomes essential.
In this study, researchers inserted green fluorescent protein (mGFP5) downstream of the Cauliflower Mosaic Virus (CamV) 35S promoter and added a histidine tag to use it as a reporter gene for protein expression. Transformants were selected using Hygromycin B, and after subculturing for over twenty generations, the transformation remained stable. The pCAMBIA1302 plasmid employed in this work can be readily adapted to contain any gene of interest. Furthermore, the method and materials presented can be adjusted for other green algae species with an active CamV35S promoter, as this promoter is used for Hygromycin selection.

Autor destacado: Protocolo de transformación optimizado para Chlorella vulgaris utilizando Agrobacterium tumefaciens 

Agrobacterium tumefaciens-Ingeniería genética mediada por microalgas verdes, Chlorella vulgaris

The scope of the research focused on the development and optimization of a protocol for the transformation of chlorella vulgaris. We aimed to create a stable transgenic strains of chlorella vulgaris using agrobacterium tumefaciens and a specific plasmid, pCAMBIA1302, that allowed them to insert gene of interest and the potential for bio technological applications. Metabolic engineering and synthetic biology, microscopy and imaging, CRISPR-Cas9 gene editing, bioinformatics, computational modeling, remote sensing and satellite imaging, nanotechnology, bioprocessing, and downstream processing.This study introduces an optimized agrobacterium tumefaciens media transformation protocol for the microalgae chlorella vulgaris using a specific plasmid and marker. It lays groundwork for enhancing microalgae by technology, overcoming previous limitations in reliable transformation tools for C.vulgaris.

Para demostrar el éxito de la transformación utilizando el método anterior, C. vulgaris se cocultivó con AGL-1 que contenía el plásmido pCAMBIA1302 o sin el plásmido (tipo salvaje y se colocó en agar TAP suplementado con higromicina B y cefotaxima (Figura 1A). La placa más a la izquierda muestra las colonias transformadas capaces de crecer en las placas de higromicina B/cefotaxima, y la placa del medio muestra que AGL-1 de tipo salvaje no puede crecer en las placas de higro...

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Este protocolo describe la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar genes de interés en el genoma nuclear de la microalga verde Chlorella vulgaris, lo que conduce a la producción de transformantes estables.

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

El alcance de la investigación se centró en el desarrollo y optimización de un protocolo para la transformación de chlorella vulgaris. Nuestro objetivo fue crear una cepa transgénica estable de chlorella vulgaris utilizando agrobacterium tumefaciens y un plásmido específico, pCAMBIA1302, que les permitiera insertar genes de interés y potencial para aplicaciones biotecnológicas. Ingeniería metabólica y biología sintética, microscopía e imágenes, edición de genes CRISPR-Cas9, bioinformática, modelado computacional, teledetección e imágenes satelitales, nanotecnología, bioprocesamiento y procesamiento posterior.Este estudio presenta un protocolo optimizado de transformación de medios de agrobacterium tumefaciens para la microalga chlorella vulgaris utilizando un plásmido y un marcador específicos. Sienta las bases para la mejora de las microalgas mediante la tecnología, superando las limitaciones anteriores en herramientas de transformación fiables para C. vulgaris.

agrobacterium-tumefaciens-mediated-genetic-engineering-green

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

2.2K vistas.  University of Waterloo. El alcance de la investigación se centró en el desarrollo y optimización de un protocolo para la transformación de chlorella vulgaris. Nuestro objetivo fue crear una cepa transgénica estable de chlorella vulgaris utilizando agrobacterium tumefaciens y un plásmido específico, pCAMBIA1302, que les permitiera insertar genes de interés y potencial para aplicaciones biotecnológicas. Ingeniería metabólica y biología sintética, microscopía e imágenes, edición de genes CRISPR-Cas9, bi...

Video: Autor destacado: Protocolo de transformación optimizado para Chlorella vulgaris utilizando Agrobacterium tumefaciens 

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit the capacity for gene transfer to a diverse array of species. Numerous microalgae species lack well-established methods for reliably integrating genes of interest into their nuclear genome. To harness the potential benefits of microalgal biotechnology, simple and efficient genome manipulation tools are crucial. Herein, an optimized AMT protocol is presented for the industrial microalgae species Chlorella vulgaris, utilizing the reporter green fluorescent protein (mGFP5) and the antibiotic resistance marker for Hygromycin B. Mutants are selected through plating on Tris-Acetate-Phosphate (TAP) media containing Hygromycin B and cefotaxime. Expression of mGFP5 is quantified via fluorescence after over ten generations of subculturing, indicating the stable transformation of the T-DNA cassette. This protocol allows for the reliable generation of multiple transgenic C. vulgaris colonies in under two weeks, employing the commercially available pCAMBIA1302 plant expression vector.

This protocol outlines the utilization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) for integrating gene(s) of interest into the nuclear genome of the green microalgae Chlorella vulgaris, leading to the production of stable transformants.

Investigación

Bioingeniería

Preparation of Electrocompetent Agrobacterium tumefaciens Culture for Microalgal Genetic Engineering

Preparation of Electrocompetent  Agrobacterium tumefaciens  Culture for Microalgal Genetic Engineering  

Start by diluting 0.5 microliters of the overnight cultures of Agrobacterium tumefaciens culture with 50 milliliters of autoclaved ultrapure water. Spread 10 microliters of this diluted culture on a lysogeny broth or LB plate. Incubate the plate at 28 to 30 degrees Celsius for one to three days.Now, inoculate a single colony in 20 milliliters of LB media supplemented with rifampicin. Incubate the culture overnight at 28 to 30 degrees Celsius. The next day, inoculate 500 milliliters of plain LB media in a shaker flask with nine milliliters of overnight culture.Place the cultures on a shaker at 28 to 30 degrees Celsius. Following incubation and dividing the cultures into tubes, centrifuge the chilled tubes at four degrees Celsius and 4, 000 G for 15 minutes. Using a pipette, remove the supernatant and resuspend each pellet in 50 milliliters of ice cold water.After centrifuging and discarding the supernatant, resuspend the pellet in 25 milliliters of ice cold water in each tube. Centrifuge as before, then resuspend the pellet in one milliliter of ice cold 10%glycerol. Now, combine the contents of all the tubes into a single 50-milliliter tube before centrifuging.Finally, after discarding the supernatant, resuspend the pellet in 400 microliters of ice cold glycerol.

Preparación de cultivo electrocompetente de Agrobacterium tumefaciens para ingeniería genética de microalgas

Electroporation of Agrobacterium tumefaciens for Genetic Engineering of Microalgal Cells

Electroporation of  Agrobacterium tumefaciens  for Genetic Engineering of Microalgal Cells  

Begin by adding 50 microliters of electrocompetent Agrobacterium tumefaciens cells into a pre-chilled 0.1-millimeter Q-vet. Add two microliters of pCAMBIA1302 to the Q-vet. now use an electroporator at 2, 400 volts to eelectroporate the cells.Immediately add one milliliter of LB media to the Q-vet and pipette the solution up and down to mix gently. Next, transfer the resuspended cells into a 1.5-milliliter microtube. Then incubate it at 24 to 30 degrees Celsius for a minimum of one hour to recover.Now plate the cells on antibiotic supplemented LB auger. Incubate the plates at 28 to 30 degrees Celsius for two to three days. Finally, inoculate a single colony in LB broth.Allow the culture to grow overnight. Then cryopreserve the plasmid-containing strain with a 50%glycerol solution at 80 degrees Celsius for future use.

Electroporación de Agrobacterium tumefaciens para ingeniería genética de células de microalgas

Agrobacterium-Mediated Transformation of Chlorella vulgaris and Confirmation of Gene Integration via Colony PCR (cPCR)

Agrobacterium-Mediated Transformation of Chlorella vulgaris  and Confirmation of Gene Integration via Colony PCR (CPCR)  

Begin by pipetting out 0.5 milliliters of a log phase culture of chlorella vulgaris. Spread the culture on at Tris-Acetate-Phosphate or TAP Agar plate. Grow the culture for five days at 25 degrees Celsius.Next, inoculate 10 milliliters of supplemented LB broth with a loop full of electroporated agrobacterium tumefaciens culture in a shaker flask. Incubate the flask at 28 to 30 degrees Celsius and 250 RPM overnight. The next day, inoculate one milliliter of the overnight culture into 50 milliliters of supplemented LB.Incubate the flask at 28 to 30 degrees Celsius and 250 RPM.To co-cultivate the algal and bacterial cultures. First, transfer the agrobacterium culture into a 50 milliliter tube. Centrifuge the tube at 4, 000 G for 30 minutes at room temperature.Then, pipette out the supernatant to discard it and wash the cells twice using the induction medium. Next, add 25 milliliters of induction media onto the Chlorella Vulgaris culture plate. Transfer the cells into a 50 milliliter tube, then centrifuge at 4, 000 G for 15 minutes at room temperature.After disposing of the supernatant, combine the algal cell pellet with 200 microliters of the bacterial suspension. Shake the combined culture in a rotary incubator at 21 to 25 degrees Celsius, said at 150 RPM for one hour. Spread 200 microliters of the mixed culture onto induction medium plates, supplemented with 15 millimoles of glucose and incubate the plates in the dark at 21 to 25 degrees Celsius for three days.After three days, collect the microalgae into a flask using 10 milliliters of TAP media. Supplemented with 20 milligrams per liter of tetracycline. Incubate the flask in the dark for two days, maintaining a temperature between 21 to 25 degrees Celsius.Plate 500 microliters of the culture onto selective media supplemented with 20 milligrams per liter of tetracycline. Incubate the plates at 21 to 25 degrees Celsius in darkness for two days, before shifting them into an illuminated chamber. Select single colonies from the transformation plate and streak them onto TAP agar plates.To perform colony PCR, start by adding a small volume of the transformant algal cells to 10 microliters of sterile water. Boil the solution at 98 degrees Celsius for 15 minutes. Similarly process another PCR template for the confirmation of agrobacterium absence in the sample.Run the PCR samples on a DNA agarose gel with a ladder, to verify the size of the resulting fragments. Transformed colonies were able to grow on plates containing hygromycin with cefotaxime. The wild type colonies did not grow on the plates.Colonies resistant up to 70 milligrams per liter of cefotaxime were obtained. Colony PCR Amplicon of pCAMBIA1302 was absent in the algal samples. However MGFP5G in amplicon was detected in all three algal samples.Algal cultures that were repeatedly subcultures of Cefotaxime showed the absence of the virulence protein E2, indicative of plasmid absence. A significant difference in algal growth of the transformants and wild type strains were observed. Despite lower growth, the transformant had higher fluorescence levels when normalized for cell density.