Окрашивание костного мозга мышей для характеристики микроокружения миелоидного лейкоза

Для начала смешайте изолированную суспензию костного мозга мыши с суспензией костной спикулы. Пипеткой нанесите 10 микролитров клеточной суспензии на гемоцитометр для подсчета. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Затем повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах буфера FACS. Чтобы окрашивать клетки антителами к магнитному истощению, добавляют блок FC, CD45 APC и TER-119 APC. Затем промойте клеточную суспензию буфером FACS.

После центрифугирования оставшейся смеси повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах буфера FACS. Чтобы окрашивать клеточную суспензию микрогранулами для магнитного истощения, добавьте мышиный IgG и анти-APC микрогранулы. Выдержите смесь на льду в течение 20 минут.

Промойте колонку LD двумя миллилитрами буфера MACS. Ресуспендируйте клетки в буфере, затем отфильтруйте его через пятимиллилитровую пробирку с крышкой сетчатого фильтра 35 микрометров. Далее установите колонку LD на стенд магнитного сепаратора и подложите под колонку пятимиллилитровую пробирку для сбора элюированного материала.

Пипеткой введите клеточную суспензию в колонку LD и соберите отрицательный поток фракции в пробирке. Промойте колонку два раза одним миллилитром буфера MACS и соберите элюентный материал в ту же пробирку. Поместите колонку LD над новой пятимиллилитровой пробиркой.

С помощью пипетки нанесите три миллилитра буфера в колонку, затем промойте положительно меченые клетки в пятимиллилитровую пробирку. Центрифугируйте как положительную, так и отрицательную фракции, затем повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах буфера FACS. Для окрашивания CD45 TER-119 отрицательной фракцией добавляют по одному микролитру каждого антитела на каждые 10-6 клетки.

Поместите суспензию на лед на 20 минут. Затем промойте суспензию двумя миллилитрами буфера FACS перед центрифугированием. Добавьте в гранулу один миллилитр буфера и пипетку йодида пропидия для окрашивания живых клеток.

Наконец, отфильтруйте образец через клеточный фильтр с плотностью 35 микрометров в пятимиллилитровую пробирку, прежде чем анализировать клетки на многоцветном проточном цитометре. Артериальные эндотелиальные клетки значительно разрастались в микроокружении острого миелоидного лейкоза с сопутствующей потерей в популяциях синусоидального эндотелия. Небольшое увеличение мезенхимальных стромальных клеток наблюдалось в возрасте восьми недель.