Para comenzar, coloque el tejido de ratón diseccionado en un medio de cultivo celular frío que contenga 5% de FBS. Con unas tijeras de disección afiladas, picar el tejido hasta obtener fragmentos de aproximadamente cinco milímetros. Transfiera los fragmentos cortados a un tubo en C y agregue un mililitro de medio de cultivo celular.
Cargue el tubo C en el dispositivo motorizado y coloque la placa de soporte del tubo sobre la parte inferior del tubo en forma de D. Enganche los brazos tensores en la placa acrílica para asegurar los tubos a la placa del motor. Para configurar un programa personalizado en el dispositivo motorizado desde el menú principal, presione el botón azul para elegir el modo personalizado.
En el primer menú de modo personalizado, presione el botón verde para especificar la duración de la rotación hacia adelante a 30 segundos. Luego presione el botón azul para seleccionar el valor en pantalla. En el segundo menú de modo personalizado, presione el botón verde para especificar la duración de la rotación inversa a 10 segundos.
Luego presione el botón azul para seleccionar el valor en pantalla. En el tercer menú de modo personalizado, presione el botón rojo para especificar los bucles de selección a cuatro veces. Luego presione el botón azul para seleccionar el valor en pantalla.
Ajuste el dial de control de voltaje a 200 RPM e inicie el programa personalizado. A continuación, agregue la enzima de digestión en cuatro mililitros de medios de cultivo en frío que contengan tejidos disecados. Nuevamente, cargue el tubo C en el dispositivo y repita el programa personalizado como se demostró anteriormente.
Después de la ejecución, transfiera el dispositivo con los tubos cargados a una incubadora a 37 grados Celsius durante 45 minutos. A continuación, cargue el tubo C en el dispositivo y configure el programa personalizado a 50 RPM con rotación hacia adelante en 270 segundos. Rotación inversa a 30 segundos y bucle nueve veces.
Agregue EDTA a una concentración final de cinco milimolares a la muestra. Establezca el programa personalizado en 100 RPM con rotación hacia adelante en 30 segundos. Rotación inversa a 10 segundos y bucle dos veces.
A continuación, pase la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros y recoja el filtrado en un tubo de 50 o 15 mililitros. Centrifugar la suspensión celular recolectada a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube durante un minuto.
Neutralizar el tampón de lisis con nueve mililitros de PBS frío. Nuevamente, centrifugue las celdas y vuelva a suspender el gránulo en el tampón o medio deseado. La suspensión celular preparada con un dispositivo motorizado y disociación manual mostró una viabilidad celular y rendimientos comparables en los tejidos pulmonares, renales y cardíacos de ratón.
Las poblaciones de células inmunitarias, como las células T y las células dendríticas, no se vieron afectadas significativamente por el protocolo de aislamiento. La expresión de marcadores de superficie también mostró frecuencias similares de células T aisladas en la intensidad de fluorescencia media para el marcador de presentación de antígenos MHC II en células dendríticas entre el aislamiento manual y el dispositivo.
