Incubation de billes de Concanavalin-A séquestrées dans des myoblastes de souris avec des anticorps pour le test CUT&Tag

Pour commencer, pipetez trois microlitres d’anticorps H3K4me1 dans un tube contenant 150 microlitres de tampon d’anticorps. Pipeter l’anticorps dilué dans chaque tube d’une bande de huit tubes PCR contenant des myoblastes de souris séquestrés dans des billes de Concanavalin A. Retournez les tubes plusieurs fois pour bien mélanger le contenu.

Ensuite, placez les tubes pendant la nuit sur un agitateur Motion à bascule à quatre degrés Celsius. Le lendemain, après avoir clarifié les échantillons sur un support magnétique, pipetez le surnageant. Ajoutez 50 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans chaque tube d’échantillon après avoir aspiré le surnageant.

Mélangez les tubes d’échantillon par inversion et incubez sur un agitateur à bascule pendant une heure à température ambiante. Jeter le surnageant de l’échantillon clarifié. Ensuite, pipetez 200 microlitres de DIG Wash Buffer dans chaque tube.

Replacez les tubes sur le support magnétique et pipetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon 300 DIG contenant pA/G-Tn5a dans chaque tube. Une fois l’incubation terminée, replacez les tubes sur le support magnétique.

Ensuite, pipetez le surnageant clarifié. Ajoutez maintenant 200 microlitres de tampon 300 DIG dans chaque tube. Placez les tubes d’échantillon sur un agitateur pendant trois minutes à température ambiante.

Après le dernier lavage, pipetez soigneusement le surnageant de chaque tube clarifié magnétiquement. Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon de tagmentation. Enfin, incubez les tubes dans une machine PCR à 37 degrés Celsius pendant une heure sans utiliser la fonction de chauffage du couvercle de l’instrument.