Para comenzar, prepare los soportes de abrazadera y las abrazaderas de metal. Coloque los soportes de abrazadera correspondientes con una abrazadera de metal cada uno en la estación de montaje. Coloque trozos de papel húmedos esterilizados en autoclave encima de las abrazaderas metálicas.
Corta el papel a lo largo de los bordes interiores de las pinzas con el bisturí. Corta dos pedazos de papel más pequeños y mantenlos húmedos. Con unas pinzas puntiagudas, coloque ocho explantes de núcleo en el papel entre las abrazaderas de metal con sus puntos finales en las abrazaderas.
Cubra los puntos finales de los explantes del núcleo con trozos de papel más pequeños y coloque abrazaderas de metal en la parte superior. Utilice un destornillador y tornillos pequeños para fijar los explantes de núcleo entre las abrazaderas metálicas y el soporte de la abrazadera. Transfiera con cuidado los explantes de núcleo sujetados a cámaras de cultivo de silicona y llene estas cámaras con dos mililitros de medio de cultivo celular estándar.
A continuación, fije el conjunto con tornillos adicionales. Para preparar el hidrogel de colágeno, primero retire las células diana de las placas de cultivo de tejidos utilizando una solución de desprendimiento celular. A continuación, centrifugar a 400 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y luego resuspenderlo en un mililitro de medio de cultivo estándar.
A continuación, prepare una solución de reticulación mezclando 10 microlitros de PBS, 1,28 microlitros de NaOH molar y 8,72 microlitros de agua bidestilada por ensamblaje. Agregue la suspensión celular de hasta 12 ensamblajes y coloque el tubo sobre hielo. Ajuste la suspensión celular de manera que se logren las siguientes concentraciones finales.
Prepare por separado una solución de colágeno uno agregando 80 microlitros de colágeno uno por ensamble y coloque el tubo en hielo. Una vez que las soluciones estén listas en hielo, aspire el medio de cultivo celular de las cámaras que contienen los explantes del núcleo sujeto. Agregue una solución de colágeno a la solución de reticulación y mezcle pipeteando rápidamente sin crear burbujas.
Agregue 200 microlitros de la solución mezclada en las ranuras de las cámaras de silicona para cubrir los explantes individuales del núcleo del tendón. Deje que los hidrogeles polimericen durante 50 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, llene cuidadosamente las cámaras de cultivo de silicona con 1,5 mililitros del medio de cocultivo respectivo pipeteándolo en las esquinas de las cámaras.
Coloque las cámaras en una placa de Petri grande o en una caja estéril antes de colocarlas en una incubadora. Cultivar los ensambles en condiciones adecuadas, cambiando el medio de cultivo dos veces por semana. Retire los ensamblajes de las abrazaderas con unas tijeras.
Si es necesario, use pinzas para separar los explantes del núcleo del compartimento externo de hidrogel. Al cultivar el ensamble en condiciones de cultivo similares a las de una lesión durante más de 21 días, se observó que el explante del núcleo permanecía mecánicamente estirable, sin cambios en apariencia, visualmente distinguible y físicamente separable del hidrogel circundante. Además, el hidrogel circundante se compactó con el tiempo, dependiendo de la población de células sembradas, con fibroblastos derivados del tendón de Aquiles que contraen su hidrogel circundante más rápido.
La evaluación de la microscopía confocal para la viabilidad, la morfología y la propagación celular en el hidrogel de colágeno 3D reveló que la viabilidad se mantuvo durante el cultivo del ensamble hasta al menos el séptimo día. Además, la expresión génica de Vegfa y Mmps aumentó fuertemente en los explantes del núcleo, como se observó en el análisis transcriptómico. Del mismo modo, el análisis del secretoma detectó la presencia de citoquinas como el factor de crecimiento endotelial vascular en los explantes centrales.
