Для начала возьмите образцы биопсии пищевода, погруженные в кератиноцитарную бессывороточную среду, или КСФМ. Замените KSFM одним миллилитром Dispase I и инкубируйте биопсию в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров аспирируйте Dispase, не касаясь биопсии или гранул клеточного мусора.
Затем промойте биопсию с помощью DPBS. После центрифугирования биопсии используйте пипетку объемом 1000 микролитров для аспирации надосадочной жидкости. Затем добавьте 500 микролитров трипсина-ЭДТА в биопсию и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, встряхивая при 800 оборотах в минуту.
Затем проводят повторное пипетирование до получения одноклеточной суспензии. С помощью резиновой головки поршня туберкулинового шприца отфильтруйте клетки через 70-микрометровый сетчатый фильтр. После этого промойте ситечко двумя-четырьмя миллилитрами ингибитора соевого трипсина.
Затем отфильтруйте клетки через 35-микрометровое сетчатое фильтр с защелкивающимся колпачком на пятимиллилитровой полистирольной трубке с круглым дном. После центрифугирования клеточной суспензии используйте пипетку объемом 1000 микролитров для аспирации надосадочной жидкости. Ресуспендируйте клеточную гранулу в базальной мембране экстракта гидрогелевой матрицы и сформируйте капли объемом 40 микролитров в предварительно подогретой суспензии клеточной культуральной пластины.
Затем инкубируйте планшет без среды в течение 20-30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы обеспечить затвердевание капель экстракта базальной мембраны. Добавить предварительно подогретый КСФМ с добавлением 10 микромоляров Y27632. На девятые сутки наблюдалась луковичная многослойная структура в растущем ороговевшем ядре в центре органоида.
