一過性トランスフェクションによる組換えAAVの作製

まず、直径15cmの処理した培養皿10個に22ミリリットルの培養培地を加えて、細胞HEK293Tプレートします。プレートを24時間インキュベートして、70〜80%のコンフルエント度に到達します。細胞導入は、微量遠心チューブ内で試薬を混ぜ合わせて混合物を調製し、タッピングして混合します。

トランスフェクション混合物を50ミリリットルの遠心分離チューブ内の4.56ミリリットルの非添加DMEMに加え、タッピングして混合します。次に、1.37ミリリットルの滅菌ポリエチレンイミン溶液を一滴ずつ加えます。タッピングして混合し、室温で10分間インキュベートして、DNAポリエチレンイミン複合体を形成します。

この混合物を231ミリリットルの予熱済みサプリメントDMEMに加えます。各培養皿の培地を22ミリリットルのこのトランスフェクション混合物と交換し、細胞を48時間インキュベートします。PITR が蛍光レポーターをコードしている場合は、トランスフェクションされた細胞を蛍光顕微鏡で観察します。

次に、各皿から培地を集めます。800Gで10分間遠心分離し、上清を除去します。次に、10ミリリットルの予熱したPBSをプレートに加え、セルスクレーパーを使用してセルを除去します。

細胞懸濁液を細胞ペレットの入った遠心分離チューブに集めます。10ミリリットルのPBSで一度に5つの皿を洗って、すべての細胞が収集されていることを確認します。再度遠心分離して細胞をペレット化します。

rAAV抽出では、トランスフェクションした細胞ペレットを解凍し、100ミリリットルの滅菌バッファーとピペットに再懸濁して、均一な懸濁液を確保します。次に、調製したばかりの滅菌済み10%デオキシコール酸ナトリウム溶液12.5ミリリットルを加えて細胞溶解を誘導し、ピペッティングで混合します。27マイクロリットルのベンゾナーゼヌクレアーゼを加え、混合物が粘性がなくなるまで完全に混合します。

摂氏37度で1時間インキュベートし、10分ごとにボルテックスします。摂氏25度で60分間、3, 000Gで遠心分離します。0.45ミクロンのPVDFシリンジフィルターを使用して上清を新しい滅菌容器にろ過します。