FPLCによる組換えAAVの精製と特性評価

まず、精製のためにFPLCシステムを準備します。手動の指示またはカスタマイズされた方法を使用して、液体の流路を滅菌超純水で完全にすすぎます。1 ミリリットルの充填済みヘパリンカラムを接続します。

圧力アラームを調整します。そして、毎分1ミリリットルの流量で5カラム容量の超純水で洗浄します。次に、システムポンプのソリューションを切り替えて、サンプルアプリケーションの準備をします。

システムポンプBをバッファーBで洗浄し、残りの液体流路にバッファーAを充填します。または、サンプルにスーパーループを使用します。アウトレットチューブを新しい容器に挿入します。

初めて精製を行うときは、自動精製用にカスタマイズされた方法を定義します。一般的な精製設定を有効にした後、このメソッドは、サンプルインレットS1からサンプル溶液を含む注入バルブへの流路をプライミングします。次に、バッファーBの12.5%を使用して、合計5つのカラム容量でカラムを平衡化し、1分間に1ミリリットルの速度で平衡化します。

サンプルを毎分 0.5 ミリリットルでカラムに塗布し、出口ポートを使用して流れを収集します。カラムを 20 カラム容量のバッファー A で 1 m/分 1 mL 洗浄します。次に、このスキームでサンプルを毎分1ミリリットル溶出します。

溶出サンプルをフラクションコレクターを使用して1ミリリットルのフラクションで回収する場合に選択します。次に、5 カラム容量に対して 12.5% のバッファー B で 1 分間に 1 ミリリットルでカラムを再平衡化します。作成したメソッドを開き、溶出ステップを待ちます。

フラクションコレクターを使用してフラクションを収集します。また、フロースルーのアリコートを収集し、摂氏マイナス20度でフラクションを保存します。すべての精製ステップのクロマトグラムを自動的に保存して評価します。

溶出プロファイルを含みます。完了後、注入口を緩衝液から超純水に切り替え、5カラム容量で毎分1ミリリットルでカラムを洗浄します。カラムを復元し、注入口を超純水から20%エタノールに切り替え、カラム容量5回洗浄します。

rAAVを濃縮するには、分子量100キロトンのカットオフ値を持つ15ミリリットルの遠心フィルターユニットに、目的のFPLCフラクションをロードします。室温で2, 000 Gで2分間遠心分離し、約500マイクロリットルの濃縮容量に到達します。遠心フィルターユニットに1ミリリットルの滅菌PBSを追加して、バッファー交換を続行します。

ピペッティングでフィルターを洗浄します。そして、500マイクロリットルの容量に達するまで1分間隔で遠心分離します。この500マイクロリットルのサンプルを100キロダルトンのカットオフを備えた0.5ミリリットルの遠心フィルターユニットに移すことにより、rAAVをさらに濃縮します。

そして、容量が100マイクロリットル未満になるまで、1分間隔で6, 000Gで遠心分離します。フィルター装置を新しいマイクロ遠心分離管に反転させ、遠心分離機でrAAVをチューブに移すことにより、濃縮されたrAAVを回収します。rAAVを低保持マイクロ遠心チューブに分注し、摂氏マイナス80度で保存します。

rAAV調製物の純度をSDSページを使用して分析し、明確なカプシドタンパク質バンドを明らかにしました。TEMによるウイルス粒子の可視化では、中心電子が密集した空の粒子と完全な粒子が示されました。スタナープラットフォームを使用してrAAVの物理的不純物特性を評価すると、約30ナノメートルの無傷のキャプシド粒子、全体的なキャプシド力価、遊離タンパク質と凝集タンパク質、および一本鎖DNAが明らかになりました。

神経2a細胞の感染性アッセイは、高い感染性レベルを示しました。ウイルス製剤に感染した初代神経細胞培養が実証されました。保存された遺伝子導入特性。

マウス小脳にrAAVベクターをin vivoで形質導入すると、GFP発現が延長されました。哺乳類の脳における導入遺伝子発現の成功を示しています。