Name: human t lymphocyte isolation, culture and analysis of migration in vitro
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro at JoVE.com

Questo progetto è stato sostenuto dal National Institutes of Health Borse HL087088 (MK) e HL18208 (MK).

1. Isolamento dei linfociti T <ol><li> Ottenere sangue umano da un donatore sano. Lasciare che il sangue a temperatura ambiente (~ 30 min) prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Delicatamente Pipettare 3 ml di sala multimediale densità Polymorph gradiente di temperatura in un ml 8 a fondo rotondo in polistirene. Delicatamente aggiungere 3 ml di sangue intero in cima ai media Polymorph. E &#39;importante evitare la sovrapposizione dei due reagenti. </li><li> Centrifugare le provette a 500 xg per 45 minuti ...

<ol>
	<li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1.">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li><li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration.">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li><li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions.">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li></ol>

In questo esperimento, forniamo i dettagli su un sistema semplice per analizzare la motilità del primario linfociti T umani. Saggi di migrazione in vitro sono stati utilizzati per sezionare i ruoli di molte molecole e le vie di segnalazione coinvolte nella locomozione dei vari tipi di cellule. Alcuni controlli critici da tenere a mente quando si progetta l&#39;esperimento proprio dal nostro protocollo sono: 1) non-adesivo o non-integrina rivestimenti substrato adesivo, come sieroalbumina bovina (BSA) ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>SH300070.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Step Polymorphs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>AN221725</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Remel/Fisher Scientific</td>
<td>R30852801</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human IL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>202-IL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human IL-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>247-IL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>19459</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human ICAM-1/Fc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>720-IC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human SDF-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>350-NS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

human t lymphocyte isolation, culture and analysis of migration in vitro

La migrazione dei linfociti T richiede l&#39;interazione adesiva delle integrine superficie cellulare con ligandi espressi su altre cellule o con proteine ​​della matrice extracellulare. L&#39;attivazione delle integrine preciso spazio-temporale da uno stato a bassa affinità ad uno stato ad alta affinità al bordo cellula principale è importante per la migrazione dei linfociti T<sup&gt; 1</sup&gt;. Allo stesso modo, retrazione del bordo d&#39;uscita delle cellule, o uropod, è un passo necessario a mantenere persistente integrina-dipendente motilità dei linfociti T<sup&gt; 2</sup&gt;. Molti approcci terapeutici per autoimmuni o infiammatorie integrine obiettivo malattie come mezzo per inibire l&#39;eccessiva reclutamento e la migrazione dei leucociti<sup&gt; 3</sup&gt;. Per studiare gli eventi molecolari che regolano la migrazione dei linfociti T umani, abbiamo utilizzato un<em&gt; In vitro</emSistema&gt; per analizzare la migrazione delle cellule su un substrato bidimensionale che simula l&#39;ambiente che un linfocita T incontra durante il reclutamento dal sistema vascolare. Linfociti T vengono prima isolati da donatori umani e vengono poi stimolati e in coltura per 7-10 giorni. Durante il test, i linfociti T possono aderire e migrare su un substrato rivestito con molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), un ligando per integrina LFA-1 e cellule stromali derivate fattore-1 (SDF-1). I nostri dati mostrano che i linfociti T presentano una velocità migratorio di ~ 15 micron / min. La migrazione dei linfociti T può essere inibita dal blocco delle integrine<sup&gt; 1</sup&gt; O con inibitori della macchina actomiosina cellulare che regola la migrazione delle cellule<sup&gt; 2</sup&gt;.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

La migrazione dei linfociti T si verifica durante homing verso gli organi linfoidi, uscire dal sistema vascolare, e di entrare in tessuti periferici. Qui, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per analizzare la migrazione dei linfociti T<em&gt; In vitro</em&gt;.

Isolamento linfociti T umani, la cultura e l&#39;analisi delle migrazioni In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

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