Name: human t lymphocyte isolation, culture and analysis of migration in vitro
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00
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Este proyecto fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HL087088 (MK) y HL18208 (MK).

1. Aislamiento de linfocitos T humanos <ol><li> Obtener sangre humana de un donante sano. Permitir que la sangre se enfríe a temperatura ambiente (~ 30 min) antes de proceder al siguiente paso. </li><li> Suavemente la pipeta de 3 ml de la temperatura ambiente media del gradiente de densidad Polimorfia en un tubo de poliestireno de 8 ml de fondo redondo. Suavemente agregar 3 ml de sangre total en la parte superior de los medios de comunicación Polimorfia. Es importante evitar la mezcla de los dos reactivos. </li><li>...

<ol>
	<li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1.">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li><li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration.">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li><li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions.">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li></ol>

En este experimento, se proporcionan detalles sobre un sistema sencillo para analizar la movilidad de primaria linfocitos T humanos. En los ensayos de migración in vitro se han utilizado para analizar el papel de muchas moléculas y vías de señalización implicadas en la locomoción de los diversos tipos de células. Algunos controles críticos a tener en cuenta a la hora de diseñar su propio experimento de nuestro protocolo son: 1) revestimientos adhesivos no adhesivo o no la integrina-su...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>SH300070.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Step Polymorphs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>AN221725</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Remel/Fisher Scientific</td>
<td>R30852801</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human IL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>202-IL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human IL-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>247-IL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>19459</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human ICAM-1/Fc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>720-IC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human SDF-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>350-NS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

human t lymphocyte isolation, culture and analysis of migration in vitro

La migración de los linfocitos T implica la interacción adhesiva de las integrinas de la superficie celular con ligandos expresados ​​en otras células o con proteínas de la matriz extracelular. La activación precisa espacio-temporal de las integrinas de un estado de baja afinidad a un estado de alta afinidad en el borde de la célula principal es importante para la migración de los linfocitos T<sup&gt; 1</sup&gt;. Del mismo modo, la retracción del borde de la célula de seguimiento o uropod, es un paso necesario en el mantenimiento persistente de la integrina dependientes de la motilidad de linfocitos T<sup&gt; 2</sup&gt;. Muchos enfoques terapéuticos para las integrinas enfermedades autoinmunes o inflamatorias objetivo como un medio para inhibir la contratación excesiva y la migración de los leucocitos<sup&gt; 3</sup&gt;. Para estudiar los eventos moleculares que regulan la migración de linfocitos T humanos, hemos utilizado un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para analizar la migración de células sobre un sustrato de dos dimensiones que simula el medio ambiente que un linfocito T se encuentra en la contratación de la vasculatura. Los linfocitos T son los primeros aislados de donantes humanos y luego se estimula y se cultivan durante siete a diez días. Durante el ensayo, los linfocitos T se permite que se adhieran y migrar en un sustrato recubierto con una molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), un ligando de la integrina LFA-1, y derivado de células estromales factor-1 (SDF-1). Nuestros datos muestran que los linfocitos T presentan una velocidad migratoria de unos 15 m / min. La migración de los linfocitos T pueden ser inhibidas por bloqueo de la integrina<sup&gt; 1</sup&gt; O por los inhibidores de la maquinaria celular que regula la actomiosina la migración celular<sup&gt; 2</sup&gt;.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

La migración de los linfocitos T se produce durante la recalada de los órganos linfoides, la salida de la vasculatura, y entrar en los tejidos periféricos. Aquí se describe un protocolo que se puede utilizar para analizar la migración de los linfocitos T<em&gt; In vitro</em&gt;.

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

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