Name: double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections at JoVE.com

Werk ondersteund door subsidies van het NIH / NIDCD, toont en de Schmitt Stichting RP.

Dit protocol is ontwikkeld en verfijnd op basis van standaard radioactief en niet-radioactieve in-situ hybridisatie methoden, die eerder door ons ontwikkelde en anderen om een of twee transcript soorten op te sporen in het hersenweefsel 1-7. Het protocol hieronder beschreven heeft een totale lengte van 2 of 3 dagen, afhankelijk van het aantal procedurele onderbrekingen gekozen door de eindgebruiker. Alle stappen hieronder weergegeven dienen te worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, met uitzondering ...

<ol>
	<li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+methods+and+applications.">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li><li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li><li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digoxigenin:anti-digoxigenin+(DIG)+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system.">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li><li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes:+facts+and+artifacts.">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li><li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization.">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li><li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds.">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li><li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+participate+in+the+brain's+response+to+birdsong+auditory+stimulation.">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li><li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds.">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li><li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression.">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol.">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li></ol>

Wij hebben gebruik gemaakt van dit protocol te onderzoeken hoe de gewervelde hersenen neurochemisch en functioneel georganiseerd, en hoe gedragsmatig-relevante zintuiglijke prikkels invloed hebben op de genomische machinerie van neuronen in het volwassen brein 80-10 te bepalen. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode in hersenweefsel van muizen, ratten en zangvogels, maar verwachten dat dit protocol zal worden eenvoudig aan te passen aan de hersenen verkregen na een reeks van gewervelde soorten ...

Oplossingen <ol><li> Column wassen buffer: 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 ug / ul tRNA, 0,1% SDS in 50 ml DEPC-behandeld water. </li><li> Column blokkerende buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA in 50 ml DEPC-behandeld water. </li><li> TNT buffer: 60 ml van 1 M Tris-HCl, 18 ml 5 M NaCl en 1,8 ml van Triton X-100 in 600 ml DEPC-behandeld water. </li><li> TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8,3 ng / ul BSA, 0,15 M NaCl en 3% Triton X-100 in DEPC-behandeld water. </li><li> TE-buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 en 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> Acetylering oplossing: 2,7 ml van triethanolamine plus 0,5 ml azijnzuuranhydride in 200 ml DEPC-behandeld water. </li><li> Hybridisatie-oplossing: 50% formamide, 2x SSPE, 2 ug / ul tRNA, 1 ug / ul BSA en 1 ug / ul poly A in DEPC-behandeld water. Het moet 16 l per sectie. </li></ol>

double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections

Hier beschrijven we een aangepaste versie van een dubbele fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (dFISH) methode geoptimaliseerd voor het detecteren van twee mRNA&#39;s van de interesse in vriesverse hersenen secties. Onze groep heeft met succes gebruik gemaakt van deze aanpak van de gen co-regulering te bestuderen. Meer specifiek, hebben we gebruik gemaakt van deze dFISH methode om de anatomische organisatie, neurochemische eigenschappen en de impact van de zintuiglijke ervaring in het centrum van zintuiglijke circuits te verkennen, op enkele cel resolutie. Dit protocol is gevalideerd in het hersenweefsel van muizen, ratten en zangvogels, maar zal naar verwachting worden eenvoudig aan te passen aan andere gewervelde diersoorten, alsmede op een array van niet-neurale weefsels. In deze film geven we een gedetailleerde demonstratie van de belangrijkste stappen van deze procedure.

Watch this Scientific Journal Video about Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections at JoVE.com

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Dit protocol betreft een niet-radioactieve<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisatie procedure dat de gelijktijdige identificatie van twee transcript soorten mogelijk maakt, op een enkele cel resolutie, in dunne delen van de gewervelde hersenen.

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

De combinatie van Lipophilic kleurstof, In situ Hybridisatie, immunohistochemie, en Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometrische analyses van het netvlies secties

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Ontwerp en Montage van een Ultra-light Gemotoriseerde Microdrive voor Chronische Neurale Opnamen in Kleine Dieren

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Snel<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met behulp van oligonucleotideprobes op Paraformaldehyde vooraf hersenen van ratten met Serotonine Syndroom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Lokalisatie van Receptorgenen van Reukstof in Locustantenne door RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Dubbele directe bloedinjectie in de Cisterna Magna als model van subarachnoïdale bloeding

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...