Name: double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00
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Lavoro sostenuto dalle concessioni di NIH / dell&#39;NIDCD e la Fondazione Schmitt a RP.

Questo protocollo è stato sviluppato e raffinato basato sullo standard radioattivi e non radioattivi in situ metodi di ibridazione, in precedenza sviluppato da noi e gli altri di individuare uno o due specie di trascrizione nel tessuto cerebrale 1-7. Il protocollo descritto di seguito ha una lunghezza totale di 2 o 3 giorni, a seconda del numero di interruzioni procedurale scelto dall&#39;utente finale. Tutti i passaggi dettagliati di seguito sono essere condotte a temperatura ambiente, con l&#39;ec...

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	<li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+methods+and+applications.">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li><li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li><li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digoxigenin:anti-digoxigenin+(DIG)+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system.">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li><li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes:+facts+and+artifacts.">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li><li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization.">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li><li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds.">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li><li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+participate+in+the+brain's+response+to+birdsong+auditory+stimulation.">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li><li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds.">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li><li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression.">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol.">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li></ol>

Abbiamo usato questo protocollo per studiare come il cervello dei vertebrati è neurochemically e funzionalmente organizzato, e per determinare come comportamentale rilevante per l&#39;impatto sensoriale stimoli il meccanismo genomico dei neuroni nel cervello adulto 8-10. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo nel tessuto cerebrale di topi, ratti e uccelli canori, ma prevediamo che questo protocollo sarà facilmente adattabile alle sezioni del cervello ottenute da una serie di specie di vertebrati e, f...

Soluzioni <ol><li> Colonna del buffer di lavaggio: 10 mM Tris-HCl 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 mg / tRNA microlitri, 0,1% SDS in 50 ml DEPC-acqua trattata. </li><li> Colonna tampone di bloccaggio: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA in 50 ml DEPC-acqua trattata. </li><li> TNT buffer: 60 ml di 1 M Tris-HCl, 18 ml di NaCl 5 M e 1,8 ml di Triton X-100 in 600 ml di DEPC trattati con acqua. </li><li> TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 mg / microlitri BSA, 0,15 M di NaCl e il 3% Triton X-100 in DEPC trattati con acqua. </li><li> TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 e 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> Acetilazione soluzione: 2,7 ml di trietanolammina più 0,5 ml di anidride acetica in 200 ml di DEPC trattati con acqua. </li><li> Ibridazione soluzione: il 50% formammide, 2X SSPE, 2 mg / tRNA microlitri, 1 mg / BSA microlitri e 1 mg / mL poli A in acqua DEPC-trattata. Ha bisogno di 16 l per sezione. </li></ol>

double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections

Qui si descrive una versione modificata di una fluorescenza doppio<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; (dFISH) metodo ottimizzato per il rilevamento di due mRNA di interesse fresco sezioni cervello congelato. Il nostro gruppo ha utilizzato con successo questo approccio per lo studio genetico di co-regolamentazione. Più in particolare, abbiamo utilizzato questo metodo dFISH per esplorare l&#39;organizzazione anatomica, le proprietà neurochimiche, e l&#39;impatto dell&#39;esperienza sensoriale nel centro di circuiti sensoriali, a risoluzione singola cellula. Questo protocollo è stato convalidato nel tessuto cerebrale di topi, ratti e uccelli canori, ma dovrebbe essere facilmente adattabile alle altre specie di vertebrati, come pure una serie di non-tessuti neurali. In questo film ci fornisce una dimostrazione dettagliata delle tappe principali di questa procedura.

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Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Questo protocollo comporta un non radioattivo<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; procedura che consente l&#39;identificazione simultanea di due specie di trascrizione, ad una risoluzione singola cella, in sezioni sottili del cervello dei vertebrati.

Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Ricerca

Neuroscienze

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Le analisi morfometriche delle sezioni della retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Progettazione e assemblaggio di un ultraleggero motorizzato per Microdrive croniche Recordings neurali in animali di piccola taglia

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in larvale Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapido<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell&#39;antenna di Locust da RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Doppia iniezione diretta di sangue nella Cisterna Magna come modello di emorragia subarachnoide

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Doppia fluorescenza In situ nelle sezioni cervello fresco