Name: double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00
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El trabajo apoyado por subvenciones del NIH / NIDCD y la Fundación de Schmitt a la PR.

Este protocolo fue desarrollado y perfeccionado sobre la base de los métodos estándar de hibridación radiactivos y no radiactivos in situ, desarrollado previamente por nosotros y otros para detectar una o dos especies de transcripción en el tejido cerebral 1-7. El protocolo se describe a continuación tiene una longitud total de 2 o 3 días, dependiendo del número de interrupciones del procedimiento elegido por el usuario final. Todos los pasos detallados a continuación se llevarán a cabo a te...

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	<li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+methods+and+applications.">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li><li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li><li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digoxigenin:anti-digoxigenin+(DIG)+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system.">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li><li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes:+facts+and+artifacts.">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li><li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization.">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li><li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds.">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li><li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+participate+in+the+brain's+response+to+birdsong+auditory+stimulation.">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li><li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds.">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li><li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression.">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol.">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li></ol>

Hemos utilizado este protocolo para estudiar cómo el cerebro de los vertebrados es neuroquímico y funcionalmente organizada, y para determinar la conducta relevante impacto estímulos sensoriales de la maquinaria del genoma de las neuronas en el cerebro adulto 80-10. Hemos utilizado con éxito este método en el tejido cerebral de ratones, ratas y pájaros, pero anticipamos que este protocolo se adapta fácilmente a las secciones del cerebro obtenidas de una gran variedad de especies de vertebrados y, quiz?...

Soluciones <ol><li> Columna de tampón de lavado: 10 mM Tris-HCl, NaCl 0,15 M, 0,05 mM EDTA, 50 mg / l tRNA, SDS 0,1% en 50 ml de agua tratada con DEPC. </li><li> Columna de tampón de bloqueo: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA en 50 ml de agua tratada con DEPC. </li><li> TNT búfer: 60 ml de 1 M Tris-HCl, 18 ml de 5 M NaCl y 1,8 ml de Triton X-100 en 600 ml de agua tratada con DEPC. </li><li> TNB búfer: 100 mM Tris-HCl, 8,3 mg / l de BSA, NaCl 0,15 M y el 3% Triton X-100 en agua tratada con DEPC. </li><li> Tampón TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 y 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> Solución de la acetilación: 2.7 ml de trietanolamina más 0,5 ml de anhídrido acético en 200 ml de agua tratada con DEPC. </li><li> Solución de hibridación: formamida al 50%, 2x SSPE, 2 mg / l tRNA, 1 mg / l de BSA y 1 mg / l poli A en el agua tratada con DEPC. Se necesita 16 litros por sección. </li></ol>

double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections

Aquí se describe una versión modificada de un fluorescente doble<em&gt; In situ</emHibridación&gt; (dFISH) método optimizado para la detección de dos mRNAs de interés en nuevas secciones del cerebro congelado. Nuestro grupo ha utilizado con éxito este enfoque para el estudio de genes co-regulación. Más específicamente, hemos utilizado este método para explorar dFISH la organización anatómica, propiedades neuroquímicas, y el impacto de la experiencia sensorial en el centro de los circuitos sensoriales, con una resolución única célula. Este protocolo ha sido validado en el tejido cerebral de ratones, ratas y pájaros, pero se espera que sea fácilmente adaptable a otras especies de vertebrados, así como a una amplia gama de tejidos no neuronales. En esta película una demostración detallada de las principales etapas de este procedimiento.

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Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Este protocolo consiste en un no-radiactivos<em&gt; In-situ</emProcedimiento&gt; hibridación que permite la identificación simultánea de dos especies de transcripción, en una resolución única célula, en secciones finas de cerebro de los vertebrados.

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

La combinación de colorantes lipofílicos, In situ</emHibridación>, inmunohistoquímica y la histología

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Investigación

Neurociencias

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Los análisis morfométricos de las Secciones de retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Diseño y montaje de un Microdrive ultraligero motorizado para crónicos Grabaciones neuronales en Pequeños Animales

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...