Name: double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections at JoVE.com

Arbetet stöds av bidrag från NIH / NIDCD och Schmitt stiftelsen till RP.

Detta protokoll har utvecklats och förfinats baserat på standard radioaktiva och icke radioaktiva in situ hybridisering metoderna, som tidigare utvecklats av oss och andra att upptäcka en eller två avskrift arter i hjärnvävnaden 1-7. Protokollet som beskrivs nedan har en total längd av 2 eller 3 dagar, beroende på antal processuella avbrott valts av slutanvändaren. Alla steg som beskrivs nedan ska utföras vid rumstemperatur, med undantag av riboprobe hybridisering steg och efter hybridiseri...

<ol>
	<li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+methods+and+applications.">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li><li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li><li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digoxigenin:anti-digoxigenin+(DIG)+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system.">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li><li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes:+facts+and+artifacts.">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li><li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization.">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li><li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds.">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li><li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+participate+in+the+brain's+response+to+birdsong+auditory+stimulation.">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li><li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds.">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li><li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression.">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol.">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li></ol>

Vi har använt detta protokoll för att studera hur ryggradsdjur hjärnan neurochemically och funktionellt organiserad, och att avgöra hur beteendemässigt relevant för sensoriska stimuli påverkar arvsmassans maskineri av nervceller i den vuxna hjärnan 8-10. Vi har framgångsrikt använt denna metod i hjärnvävnad från möss, råttor och sångfåglar, men räknar med att detta protokoll kommer att vara lätt att anpassa till hjärnan delar från en mängd ryggradsdjur och, kanske, icke-neuronala vävnad...

Lösningar <ol><li> Kolumn tvätt buffert: 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 mikrogram / l tRNA, 0,1% SDS i 50 ml DEPC-behandlat vatten. </li><li> Kolumn blockerande buffert: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA i 50 ml DEPC-behandlat vatten. </li><li> TNT buffert: 60 ml 1 M Tris-HCl, 18 ml 5 M NaCl och 1,8 ml av Triton X-100 i 600 ml DEPC-behandlat vatten. </li><li> TNB buffert: 100 mM Tris-HCl, 8,3 mikrogram / l BSA, 0,15 M NaCl och 3% Triton X-100 i DEPC-behandlat vatten. </li><li> TE buffert: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 plus 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> Acetylering lösning: 2,7 ml trietanolamin plus 0,5 ml ättiksyraanhydrid i 200 ml DEPC-behandlat vatten. </li><li> Hybridisering Lösning: 50% formamid, 2X specialföretag, 2 mikrogram / l tRNA, 1 mikrogram / l BSA och 1 mikrogram / l poly A i DEPC-behandlat vatten. Den behöver 16 l per avsnitt. </li></ol>

double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections

Här beskriver vi en modifierad version av en dubbel fluorescens<em&gt; På plats</em&gt; Hybridisering (dFISH)-metoden optimerad för att upptäcka två mRNA av intresse i färskt frysta hjärnan sektioner. Vår grupp har framgångsrikt använt denna metod för att studera gener samreglering. Mer specifikt har vi använt denna dFISH metod för att utforska den anatomiska organisationen, neurokemiska egenskaper, och effekterna av sinnesupplevelse i centrala sensoriska kretsar på en enda cell upplösning. Detta protokoll har validerats i hjärnvävnad från möss, råttor och sångfåglar, men förväntas vara lätt att anpassa till andra ryggradsdjur, liksom till en rad icke-neurala vävnader. I den här filmen ger vi en detaljerad demonstration av de viktigaste stegen i detta förfarande.

Watch this Scientific Journal Video about Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections at JoVE.com

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Detta protokoll innebär en icke-radioaktiva<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisering förfarande som gör det möjligt att samtidigt identifiera två avskrift arter, i en enda cell upplösning, i tunna delar av ryggradsdjur hjärnan.

Dubbel Fluorescens På plats Hybridisering i Fresh Brain § §

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Kombinera lipofila färgämne, På plats Hybridisering, immunohistokemi, och histologi

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriska Analyser av näthinnans avsnitt

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Konstruktion och montering av en Motoriserad Ultralätt Microdrive för kronisk neurala inspelningar i små djur

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Komplett ryggmärgsskada och Brain Dissection protokoll för Efterföljande Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i Larvernas havsnejonöga

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Upptäckt av Axonally Lokaliserad mRNA i hjärnan sektioner Använda hög upplösning<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Snabb<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering med användning av oligonukleotidsonder på Paraformaldehyd-prefixet Brain av råttor med serotonergt syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Kombinera Double Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering med inmärkning för detektion av uttryck av tre gener i mus hjärnsektioner

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Lokalisering av luktantreceptormener i lokalisationsantennen genom RNA<em&gt; I situ</em&gt; Hybridisering

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering av Cerebral kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Dubbel direktinsprutning av blod i Cisterna Magna som en modell av Subarachnoid Hemorrhage

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...