Name: transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides at JoVE.com

We willen graag Abbie Spinner danken aan het California National Primate Research Center voor haar hulp bij flowcytometrie. Dit onderzoek werd ondersteund door de financiering van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799, en AI078183.

<ol><li> Vóór het begin van het protocol, is het van belang om vast te stellen dat de mug cellen die worden gebruikt in het experiment gezond zijn en op ~ 80% confluentie als aanhanger (figuur 1). Begroeid of ongezonde cellen zal resulteren in een lage transfectie-efficiëntie en geven inconsistente resultaten. </li><li> Warm-up van alle media voorafgaand aan in een 28 ° C waterbad te gebruiken gedurende 30 minuten. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 cellen nodig E5 medium: MEM, Earle&#39;s w / glutamine, 5% door warmte geï...

<ol>
	<li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi.">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , (2010).</li><li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid+(LNA):+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA.">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li><li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs.">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li><li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids.">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li><li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons.">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons.">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li><li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination.">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li><li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae.">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li><li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population.">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li><li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region.">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li></ol>

Hier presenteren wij een in-vitro-methode en aanwijzingen voor gerichte omzetting van een enkele nucleotide in een episomaal gen doelwit na transfectie van LNA-ONS in A. stephensi en A. gambiae cellen. LNA-ON-gemedieerde genconversie vereist inductie van een site-specifieke DNA-herstel reactie; onze gegevens blijkt dat de mug cellen kunnen dit mechanisme voor site-specifieke mutagenese ondersteuning. Terwijl de hier gepresenteerde methode is gebaseerd op de omzetting van een episomaal doel, on...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene transfection reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K4935-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LNA-ONs </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM, Earle's w/ glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s Drosophila medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides

Plasmodium parasieten, de verwekker van malaria, worden overgedragen door de beten van geïnfecteerde Anopheles muggen wat resulteert in meer dan 250 miljoen nieuwe infecties per jaar. Ondanks tientallen jaren van onderzoek, is er nog steeds geen vaccin tegen malaria, met de nadruk op de noodzaak van nieuwe bestrijdingsstrategieën. Een innovatieve aanpak is het gebruik van genetisch gemodificeerde muggen zij daadwerkelijk toezicht kunnen malaria parasiet transmissie. Opzettelijke veranderingen van de cel signaalwegen in de mug, via gerichte mutagenese, is gebleken dat parasiet ontwikkeling 1 te reguleren. Uit deze studies, kunnen we beginnen om potentiële gen doelstellingen voor de transformatie te identificeren. Gerichte mutagenese is traditioneel gebaseerd op de homologe recombinatie tussen een target-gen en een groot DNA-molecuul. Echter, de bouw en het gebruik van dergelijke complexe DNA-moleculen voor het genereren van stabiel getransformeerde cellijnen is kostbaar, tijdrovend en vaak inefficiënt. Daarom is een strategie met behulp van gesloten nucleïnezuur-gemodificeerde oligonucleotiden (LNA-ons) biedt een bruikbaar alternatief voor de invoering van kunstmatige single nucleotide substituties in episomale en chromosomaal DNA-gen doelstellingen (beoordeeld in 2). LNA-ON-gemedieerde gerichte mutagenese is gebruikt om puntmutaties introduceren in interessante genen in gekweekte cellen van zowel de gist en muizen 3,4. We tonen hier dat LNA-ons kunnen worden gebruikt om een enkele nucleotide verandering in een getransfecteerde episomale doel dat resulteert in een switch van blauw fluorescerend eiwit (BFP) uitdrukking aan green fluorescent protein (GFP) tot uitdrukking in zowel de Anopheles gambiae en Anopheles stephensi cellen te introduceren . Deze conversie toont voor het eerst dat een effectieve mutagenese van target genen in mug cellen kan worden gemedieerd door LNA-ons en suggereert dat deze techniek van toepassing kunnen zijn op mutagenese van chromosomale doelen in vitro en in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides at JoVE.com

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Oligonucleotiden kunnen worden gebruikt om de website speciaal een single nucleotide van getransfecteerde doelwitgenen vervanger in beide<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; En<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Cellen.

Transfectie en mutagenese van Target genen in cellen Mosquito door Locked Nucleic Acid-gemodificeerde oligonucleotiden

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Het identificeren van ontregelde genen geïnduceerd door Kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specifieke In Vivo Killing Assay met behulp van CFSE Labeled doelcellen

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescentie In situ Hybridisatie (LNA flow-FISH): een methode voor Bacteriële Kleine RNA-detectie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Het gebruik van mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner transposon-gemedieerde mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...