Name: transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00
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Nous tenons à remercier Abbie Spinner au Centre National Primate Research en Californie, pour son aide à la cytométrie de flux. Cette étude a été soutenue par un financement de l&#39;Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 et AI078183.

<ol><li> Avant de commencer le protocole, il est important de déterminer que les cellules de moustiques utilisés dans l&#39;expérience sont en bonne santé et au confluent ~ 80% si adhérentes (Figure 1). Cellules envahies ou insalubres se traduira par une efficacité de transfection faible et donnera des résultats inconsistants. </li><li> Warm up ensemble des médias avant d&#39;utiliser dans un bain 28 ° C eau pendant 30 mn. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 cellules ont besoin de E5 moyennes: MEM, w Earle / glutamine, ...

<ol>
	<li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi.">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , (2010).</li><li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid+(LNA):+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA.">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li><li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs.">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li><li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids.">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li><li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons.">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons.">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li><li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination.">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li><li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae.">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li><li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population.">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li><li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region.">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li></ol>

Nous présentons ici une méthode in vitro et des preuves pour la conversion ciblée d&#39;un seul nucléotide dans un gène cible épisomique après transfection de LNA-Ons dans A. stephensi et A. cellules gambiae. Conversion génique LNA-SUR-médiation nécessite l&#39;induction d&#39;un site spécifique de réponse réparation de l&#39;ADN; nos données indiquent que les cellules de moustique peut soutenir ce mécanisme de mutagenèse dirigée. Bien que la méthode présen...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene transfection reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K4935-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LNA-ONs </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM, Earle's w/ glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s Drosophila medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides

Parasites du genre Plasmodium, l&#39;agent causal de la malaria, sont transmis par les piqûres de moustiques anophèles infectés résultant dans plus de 250 millions de nouvelles infections chaque année. Malgré des décennies de recherche, il n&#39;ya toujours pas de vaccin contre le paludisme, en soulignant la nécessité de stratégies de contrôle roman. Une approche novatrice est l&#39;utilisation de moustiques génétiquement modifiés pour lutter efficacement contre la transmission du parasite du paludisme. Altérations délibérées des voies de signalisation cellulaire chez le moustique, en passant par mutagenèse ciblée, ont été trouvés pour réguler le développement du parasite 1. De ces études, nous pouvons commencer à identifier les gènes cibles potentiels pour la transformation. Mutagenèse ciblée a toujours compté sur la recombinaison homologue entre un gène cible et une molécule d&#39;ADN à grande. Cependant, la construction et l&#39;utilisation de ces molécules d&#39;ADN complexes pour la production de lignées de cellules transformées de façon stable est coûteux, fastidieux et souvent inefficace. Par conséquent, une stratégie utilisant des acides nucléiques verrouillés-oligonucleotides modifiés (LNA-ons) fournit une alternative utile pour l&#39;introduction artificielle seule substitutions nucléotidiques dans épisomiques et chromosomiques cibles gène d&#39;ADN (revue en 2). LNA-SUR-médiée mutagenèse ciblée a été utilisée pour introduire des mutations ponctuelles dans des gènes d&#39;intérêt dans les cellules cultivées à la fois de la levure et de souris 3,4. Nous montrons ici que LNA-Ons peut être utilisé pour introduire un changement d&#39;un seul nucléotide dans une cible transfectées épisomique qui se traduit par un interrupteur du bleu de protéines (BFP) l&#39;expression fluorescentes pour la protéine verte (GFP) l&#39;expression fluorescentes dans les deux Anopheles gambiae et Anopheles stephensi cellules . Cette conversion démontre pour la première fois que la mutagenèse efficace de gènes cibles dans les cellules de moustique peut être médiée par LNA-ons et suggère que cette technique peut être applicable à la mutagenèse des cibles chromosomiques in vitro et in vivo.

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Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Oligonucléotides peuvent être utilisés pour le site spécifiquement le remplacer par un seul nucléotide des gènes cibles transfectées dans les deux<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Et<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Cellules.

La transfection et la mutagenèse des gènes cibles dans les cellules de moustiques en Fermés d&#39;acide nucléique modifiés Oligonucléotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

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