Name: transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides at JoVE.com

Wir möchten Abbie Spinner an der California National Primate Research Center für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie danken. Diese Studie wurde durch Mittel aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 und AI078183 unterstützt.

<ol><li> Vor dem Start des Protokolls ist es wichtig, festzustellen, dass die Mücke Zellen im Experiment verwendeten gesund sind und bei ~ 80% Konfluenz, wenn Anhänger (Abbildung 1). Overgrown oder kranken Zellen wird in geringer Transfektionseffizienz führen und inkonsistente Ergebnisse liefern. </li><li> Warm up alle Medien vor, in einem 28 ° C Wasserbad für 30 Minuten verwenden. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 Zellen benötigen E5 Medium: MEM, Earle w / Glutamin, 5% hitzeinaktiviertem FCS, 0,2% D-Glucose, 1% Penicill...

<ol>
	<li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi.">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , (2010).</li><li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid+(LNA):+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA.">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li><li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs.">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li><li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids.">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li><li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons.">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons.">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li><li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination.">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li><li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae.">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li><li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population.">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li><li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region.">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li></ol>

Hier präsentieren wir ein in vitro Verfahren und Beweise für die gezielte Umwandlung von einem einzigen Nukleotid in einem episomalen Gen Ziel nach der Transfektion von LNA-ons in A. stephensi und A. gambiae Zellen. LNA-ON-vermittelte Gen-Konvertierung erfordert Induktion einer ortsspezifischen DNA-Reparatur-Reaktion, unsere Daten zeigen, dass Moskito-Zellen können diesen Mechanismus für die ortsspezifische Mutagenese zu unterstützen. Während die hier vorgestellte Methode auf Umwandlung ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene transfection reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K4935-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LNA-ONs </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM, Earle's w/ glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s Drosophila medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides

Plasmodium Parasiten, der Erreger der Malaria, durch den Stich infizierter Anopheles-Mücken sich in mehr als 250 Millionen Neuinfektionen pro Jahr übertragen. Trotz jahrzehntelanger Forschung gibt es noch keinen Impfstoff gegen Malaria, die die Notwendigkeit für neue Bekämpfungsstrategien. Ein innovativer Ansatz ist die Verwendung von gentechnisch veränderten Mücken wirksam zu kontrollieren Malaria-Parasiten-Übertragung. Absichtliche Veränderungen der Zell-Signalwege in der Mücke, durch gezielte Mutagenese, haben sich Parasiten Entwicklung 1 zu regeln. Aus diesen Studien, können wir beginnen, um potenzielle Gen-Targets für die Transformation zu identifizieren. Durch gezielte Mutagenese wurde traditionell auf die homologe Rekombination zwischen einem Zielgen und ein großer DNA-Molekül verlassen. Allerdings ist der Aufbau und die Verwendung solcher komplexer DNA-Moleküle für die Erzeugung von stabil transformierten Zelllinien kostspielig, zeitaufwändig und oft ineffizient. Daher stellt eine Strategie mit gesperrten Nukleinsäure-modifizierte Oligonukleotide (LNA-ons) eine sinnvolle Alternative für die Einführung von künstlichen single nucleotide Substitutionen in episomalen und chromosomale DNA Gen-Targets (reviewed in 2). LNA-ON-vermittelte gezielte Mutagenese wurde verwendet, um Punktmutationen in Genen von Interesse in kultivierten Zellen von Hefe-und Mäuse 3,4 einzuführen. Wir zeigen hier, dass LNA-ONs verwendet werden, um ein einzelnes Nukleotid Änderung in einer transfizierten episomalen Ziel, das in einem Wechsel von blau fluoreszierenden Protein (BFP) zum Ausdruck grün fluoreszierende Protein (GFP)-Expression in beiden Anopheles gambiae und Anopheles stephensi Zellen führt einzuführen . Diese Umwandlung zeigt zum ersten Mal, dass eine wirksame Mutagenese von Zielgenen in Mücke-Zellen durch LNA-ons können vermittelt werden, und schlägt vor, dass diese Technik kann für Mutagenese von chromosomalen Ziele in vitro und in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides at JoVE.com

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Oligonukleotide können die Besucher genutzt werden speziell Ersatz eines einzelnen Nukleotids von transfizierten Zielgene in beiden<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Und<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Zellen.

Transfektion und Mutagenese von Zielgenen in Mosquito-Zellen durch Locked Nucleic Acid-modifizierte Oligonukleotide

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Die Beurteilung Somatische Hypermutation in Ramos B-Zellen nach Überexpression oder Knockdown von spezifischen Genen

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...