Name: transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides at JoVE.com

우리는 유동세포계측법 그녀 도움 캘리포니아 국립 메이트 연구 센터에서 애비 스피너 감사하고 싶습니다. 이 연구는 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIAID) 보건 국립 연구소 (NIH) AI073745, AI080799 및 AI078183의 기금에 의해 지원되었다.

<ol><li> 이전 프로토콜을 시작하기 위해서는 실험에 사용되는 모기 세포가 건강하고 ~ 80 %의 합류에서 자기편 경우 (그림 1). 것을 확인하는 것이 중요합니다 자란하거나 건강하지 못한 세포는 낮은 transfection 효율의 결과하고 일관성 결과를 줄 것이다. </li><li> 30 분 28 ° C의 물을 욕조에 사용하기 전에 모든 미디어를 따뜻하게. <ol class="lalpha"><li> 멤, 얼의 W / 글루타민 5 % 열 inactivated FCS, 0.2 % D - 글루코오스, 1 % 페니실린...

<ol>
	<li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi.">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , (2010).</li><li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid+(LNA):+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA.">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li><li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs.">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li><li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids.">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li><li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons.">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons.">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li><li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination.">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li><li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae.">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li><li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population.">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li><li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region.">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li></ol>

여기 A.로 LNA 기능의 transfection 다음 episomal 유전자 대상에서 단일 염기의 목표 전환에 대한 체외 방법 및 증거를 제공 stephensi 및 A. gambiae 세포. LNA - ON - 중재 유전자 변환은 사이트 특정 DNA 수리 대응의 유도가 필요합니다, 우리의 데이터는 모기 세포가 특정 사이트 돌연변이 유발이 메커니즘을 지원할 수 있음을 나타냅니다. 방법 여기서 제시가 episomal 대상의 변환...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene transfection reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K4935-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LNA-ONs </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM, Earle's w/ glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s Drosophila medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides

Plasmodium의 기생충, 말라리아의 원인이되는 대리인은 만 250 새로운 감염이 매년 발생하는 감염 아노 펠 레스 모기의 물린 통해 전송됩니다. 연구의 수십에도 불구하고, 말라리아에 대한 백신도 새로운 제어 전략의 필요성을 강조 아직 없습니다. 한 혁신적인 접근은 효과적으로 말라리아 기생충 전송을 제어하는​​ 유전자 조작 모기를 사용하는 것입니다. 대상 돌연변이 유발을 통해 모기의 세포 신호 전달 경로의 고의적인 변경은, 기생충 개발 1 조절 발견되었습니다. 이러한 연구에서, 우리는 변화를위한 잠재적인 유전자 목표를 식별하기 시작할 수 있습니다. 타겟 돌연변이 유발은 전통적으로 대상 유전자와 대형 DNA 분자 사이의 동종 재조합에 의존하고 있습니다. 그러나, 안정적으로 변형 세포 라인의 생성 등 복잡한 DNA 분자의 건설 및 사용은 비용, 시간 소요 종종 비효율적이다. 따라서, 고정 핵산 - 수정 oligonucleotides (LNA 기능)을 사용하여 전략 episomal 및 염색체 DNA의 유전자 타겟 (2 검토)에 인공 단일 염기 대체를 소개하는 유용한 대안을 제공합니다. LNA - ON - 중재 대상으로 돌연변이 유발은 효모와 생쥐 3,4 모두 교양 세포에 대한 관심의 유전자에 변이 점을 소개하기 위해 사용되었습니다. 우리는 LNA 기능이 아노 펠 레스 gambiae과 아노 펠 레스 stephensi 세포 모두에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현에 파란색 형광 단백질 (BFP) 표현에서 스위치로 이어지는 transfected episomal 대상에서 하나의 염기 변화를 소개하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시 . 이 변환은 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발 효과가 LNA 기능에 의해 중재이 기술은 체외에서 생체내의 염색체 돌연변이 유발 타겟에 적용 될 수있는 제안이 될 수 있다고 처음으로 보여줍니다.

Watch this Scientific Journal Video about Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides at JoVE.com

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Oligonucleotides은 특히 모두 transfected 대상 유전자의 단일 염기 대체 사이트로 사용할 수 있습니다<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt;과<em&gt; 아노 펠 레스 stephensi</em&gt; 세포.

옥내 핵산 - 수정 Oligonucleotides에 의해 Transfection 및 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

연구

면역학 및 감염병학

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

항원 특정 VIVO에서</emCFSE 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

특정 유전자의 Overexpression 또는 최저 후 라모스의 B 세포에서 체세포 Hypermutation을 평가

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별<em&gt; 녹농균</em&gt; 사용 미니<em&gt; himar1</em&gt; 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...