Name: transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Abbie Spinner no Centro de Pesquisa California National Primate por sua assistência com citometria de fluxo. Este estudo foi suportado por financiamento do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) AI073745, AI080799 e AI078183.

<ol><li> Antes de iniciar o protocolo, é importante determinar que as células de mosquitos utilizados no experimento são saudáveis ​​e na confluência ~ 80% se aderente (Figura 1). Abandonada células ou insalubre resultará em eficiência de transfecção baixo e dará resultados inconsistentes. </li><li> Aquecer toda a mídia antes do uso em um banho de água 28 ° C por 30 minutos. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 células requerem E5 médio: MEM, w Earle / glutamina, 5% de calor FCS inativada, 0,2% D-glucose, 1% d...

<ol>
	<li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi.">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , (2010).</li><li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid+(LNA):+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA.">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li><li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs.">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li><li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids.">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li><li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons.">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons.">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li><li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination.">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li><li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae.">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li><li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population.">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li><li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region.">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li></ol>

Aqui apresentamos um método in vitro e evidências para a conversão alvo de um único nucleotídeo em um gene alvo epissomal seguintes transfecção de LNA-ONs em A. stephensi e A. células gambiae. LNA-ON-mediada conversão gene requer indução de um site-specific resposta de reparo do DNA; nossos dados indicam que as células de mosquito pode suportar este mecanismo de site-specific mutagênese. Enquanto o método aqui apresentado é baseado na conversão de um alvo epis...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene transfection reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K4935-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LNA-ONs </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM, Earle's w/ glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s Drosophila medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides

Parasitas Plasmodium, o agente causador da malária, é transmitida através da picada de mosquitos do gênero Anopheles infectados, resultando em mais de 250 milhões de novas infecções a cada ano. Apesar de décadas de pesquisa, ainda não há vacina contra a malária, destacando a necessidade de estratégias de controle romance. Uma abordagem inovadora é a utilização de mosquitos geneticamente modificados para controlar eficazmente a transmissão do parasita da malária. Alterações deliberadas de vias de sinalização celular no mosquito, através de mutagênese alvo, foram encontradas para regular o desenvolvimento do parasita 1. A partir desses estudos, podemos começar a identificar genes alvos potenciais para a transformação. Mutagênese alvo tradicionalmente tem invocado a recombinação homóloga entre um gene alvo e uma molécula de DNA de grande porte. No entanto, a construção e utilização de tais moléculas de DNA complexas para geração de linhagens celulares estavelmente transformada é o tempo, consumindo caros e muitas vezes ineficiente. Portanto, uma estratégia usando bloqueado ácidos nucleicos modificado oligonucleotides (LNA-ONs) fornece uma alternativa útil para a introdução artificial único substituições de nucleotídeos em metas epissomal DNA cromossômico e gene (revisto em 2). LNA-ON-mediada mutagênese alvo tem sido usado para introduzir mutações pontuais em genes de interesse em cultura de células de levedura e ratos 3,4. Mostramos aqui que LNA-ONs pode ser usada para introduzir uma mudança de nucleotídeo único em um alvo transfectadas epissomal que resulta em um interruptor de azul proteína fluorescente expressão (BFP) para expressão de proteína verde fluorescente (GFP) em ambos os Anopheles gambiae e Anopheles stephensi células . Esta conversão demonstra pela primeira vez que mutagênese eficaz de genes alvo em células de mosquito pode ser mediada por LNA-ONs e sugere que esta técnica pode ser aplicável a mutagênese de alvos cromossômicas in vitro e in vivo.

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Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Oligonucleotídeos podem ser usados ​​para o site substitua especificamente um único nucleotídeo de genes-alvo transfectadas em ambos os<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; E<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Células.

Transfecção e Mutagênese de genes alvo em células de mosquito por Locked de ácido nucléico modificados Oligonucleotídeos

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

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