Name: in vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide
Uploaded: 2011-01-20T18:30:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide at JoVE.com

Arbetet har finansierats av NIDCD / NIH R01DC003915 till LO Bakaletz.

1. In vitro biofilm bildning <ol><li> Kolonier (som har odlats på lämpliga agar över natten), avbröts i media och OD 490 har justerats till 0,65 </li><li> Den resulterande bakteriesuspension var då utspädd 1:06 (1 ml bakteriesuspension + 5 ml förvärms medium) och inkuberas vid 37 ° C med 5% CO 2 i ca 3 timmar för att nå mitten log fas. </li><li> Späd mitten-log 1:2500 tillväxt fjädring med förvärms media och plats 200 mikroliter av utspädning i varje brunn på en 8-brunnars kammare bild. </li><li> Inkubera vid 37 ° C med 5% CO 2. </li><li> Efter ca 16 timmar, aspirera medium från hörnet av varje kammare och tillsätt 200 mikroliter färska, förvärmda medium - avstå längs väggen i kammaren för att inte skapa skjuvkrafter i kammaren som kan störa biofilmen. </li><li> Om inkubationstiden längre än 24 timmar, ändra medelstora var 12 timmar eller som behövs för att upprätthålla bakteriell bärkraft. </li></ol> 2. Visualisering av biofilm <ol><li> Aspirera medium från varje kammare, som beskrivits ovan, och tvätta bosatt biofilm två gånger försiktigt med steril koksaltlösning. </li><li> Tillsätt 200 mikroliter av BacLight Live / Dead bets (3 mikroliter komponent A + 3 mikroliter komponent B per ml saltlösning) till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Skydda kulturen från ljus från denna punkt och framåt. </li><li> Aspirera fläcken och tvätta två gånger försiktigt med steril koksaltlösning som tidigare. </li><li> Tillsätt 200 mikroliter neutral buffrad formalin till varje brunn och inkubera i 30 minuter i rumstemperatur att fixa exemplar. </li><li> Ta bort fixativ och kasta i enlighet med institutionella riktlinjer. </li><li> Tvätta två gånger med koksaltlösning och avyttra tvätta vätskor som innehåller formalin enligt ovan. </li><li> Ta bort plasten brunnar från bilden, lägger nog saltlösning till varje brunn så att när ett täckglas placeras på packningen, ingen luft bubblor. </li><li> Täckglas och försegla kanterna på täckglas med växande medium. Nagellack kan användas för att försegla bilderna dock bilderna inte blir lika permanenta. </li><li> Låt tätningsmedlet torka i cirka 1 timme före granska via mikroskopi. </li></ol> 3. Resultat <img src="/files/ftp_upload/2481/2481fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Representant 3D sammansatta bilder av en biofilm som bildas i en 8-brunnars kammare bild. Bakterier var märkta med Live / Dead fläcken där levande bakterier fluorescerar grönt och döda bakterier fluorescerar rött. (A) Sammansatt bild av hela biofilmen visar distinkt arkitektur med torn och kanaler vatten. (B) Samma biofilm som i (A), nu ses i genomskärning.

<ol>
	<li>Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms+in+otitis+media:+evidence+and+relevance.">Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance.</a> Pediatr Infect Dis J. 26, S17-S19 (2007).</li><li>Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li></ol>

Att förstå den mekanism genom vilken biofilm form, samt karaktäriserar deras matriskomponenterna, är ett område av stort intresse. Detta protokoll kan användas för att identifiera proteiner eller andra beståndsdelar som bidrar till den strukturella integriteten av biofilm, samt att identifiera och målproteiner som kan lämpa sig för ett terapeutiskt program. Den inkubationstiderna och utspädning i ovan beskrivna protokollet har fastställts för optimal biofilm bildning av nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi). Vissa förarbeten kan behövas för att optimera dessa steg för andra bakteriearter (dvs. första utspädning och inkubationstiden behövs för att uppnå mitten log tillväxtfas). Den 1:2500 utspädning för det första sådd av kamrarna har inrättats för att säkerställa att en robust biofilm skulle utvecklas i kammaren bilderna som orsakas av denna organism och inom inkubationstiderna anges, utan att biofilmen igenväxning kammaren och / eller utmattande tillgängliga näringsämnen . Därför kan den initiala utspädning och eller inkubationstider behöva anpassas för andra bakteriearter.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Chocolate II agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>B21267X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>8-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-656-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BacLight Live/Dead bacterial viability kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9439023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BHI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>211059</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H5533</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-NAD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N7004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Permaslip mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9693613</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide

Den kroniska natur många sjukdomar beror på bildandet av bakteriella biofilmer som är motsträviga till traditionell antibiotikabehandling. Biofilmer är community-associerade bakterier knutna till en yta och inneslutet i en matris. Den roll som den extracellulära matrisen är mångfacetterad, bland annat underlätta näringsämnen förvärvet, och ger ett betydande skydd mot miljöpåfrestningar (t.ex. värd immunsvar). I ett försök att få en bättre förståelse om hur bakterier i en biofilm svara på miljöpåfrestningar har vi använt ett protokoll där vi visualiserar bakteriella biofilmer som har bildats i en 8-brunnars kammare bild. Den biofilmer färgades med BacLight Live / Dead fläcken och undersöks med hjälp av ett konfokalmikroskop att karaktärisera den relativa biofilmen storlek och struktur under varierande inkubation förhållanden. Z-stack bilder samlades in via konfokalmikroskopi och analyseras av COMSTAT. Detta protokoll kan användas för att hjälpa till att belysa den mekanism och kinetik genom vilka biofilmer form, samt identifiera komponenter som är viktiga för biofilm struktur och stabilitet.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide at JoVE.com

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

Denna artikel beskriver förfarandet för bildandet och visualisering av en bakteriell biofilm odlas inom en 8-brunnars kammare bild

In vitro biofilm bildning i en 8-brunnars avdelningen Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Mikroteststrips Dish biofilm bildning analys

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteriskt Bakteriell invasion av tarmepitelceller<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatiskt förbättras med hjälp av en vertikal modell diffusionskammare

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hög genomströmning Mätning av extracellulärt DNA utsläpp och Kvantitativ NET bildning i humana neutrofiler<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In vitro- metoder för att jämföra målbindning och CDC-induktion mellan terapeutiska antikroppar: applikationer i biosimilaritetsanalys

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseumbindningsanalys som förutspår läkemedelspenetration i tuberkulos-lesioner

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm bildning i Candida albicans med en automatiserad mikroflödessystem enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Bile Salt-inducerad Biofilm bildning i enteriska patogener: tekniker för identifiering och kvantifiering

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...