Name: measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates at JoVE.com

Dit protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld bij Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle door Xiaolan Ye en Michael Petrascheck in het Laboratorium voor Linda Buck. De gedetailleerde versie van bovenstaande is opgesteld om de gehele procedure ter beschikking van de bredere gemeenschap te maken. Wij danken Carol Taylor, Sarah LeBoeuf en Andy Tomacelli voor het kritisch lezen van het protocol. Dit is manuscript # 2866 van het Scripps Research Institute. De Petrascheck Lab is gefinancierd door het Novartis ADI-programma.

Overzicht: Het protocol is opgesplitst in vier delen. Deel 1 beschrijft hoe voor te bereiden de voeding bacteriën. Deel 2 beschrijft hoe de voorbereiding van de worm cultuur. Deel 3 beschrijft hoe om te scoren levensduur. Part 4 toont een aantal representatieve resultaten, en in deel 5 wordt beschreven hoe u de voorbereiding van de gewenste oplossingen. Levensduur experimenten enkele weken in beslag. Voor elke stap van het protocol week, is dag en tijd van de dag opgenomen om de planning te vergemakkelijken. De L4 stadium (dag 0) wordt gebruikt als referentiepunt voor de gehele protocol. 1. De voorbereiding van Feeding bacteriën Dit gedeelte beschrijft de bereiding van de voeding bacteriën. De specifieke E. coli-stam gebruikt om C.elegans feed is genoemd OP50. Voorafgaand aan dit protocol, om kruisbesmetting van de worm cultuur met andere bacteriën te voorkomen, is de OP50 stam is gemaakt carbenicilline / ampicilline resistente 21. Bereid de OP50 vier tot vijf dagen op voorhand. Alle materialen die in contact komen met OP50 moeten steriel zijn. Dag -7: donderdag (week 1): Inoculatie 5 ml TB met 100 ug / ml ampicilline en 0,1 ng / ml amfotericine B met een OP50 kolonie en incubeer overnacht bij 37 ° C in een bacteriële shaker. Dag -6: vrijdag (week 1). &#39;S ochtends 08:30. Inoculeer vroeg om voldoende tijd voor de cultuur tot verzadiging te bereiken <ol><li> Verdun de nacht cultuur van OP50 1:2000 in 300 ml TB met 50 ug / ml ampicilline. Incubeer de cultuur in een bacteriële shaker voor 8-12 uur bij 37 ° C tot verzadiging is bereikt. Sta niet toe dat de cultuur om te groeien langer dan 14 uur. </li><li> Breng de OP50 in een steriele, pre-gewogen centrifugebuis. Pellet de OP50 door centrifugatie gedurende 10 min bij 3500 rpm (2200 xg) in een tafelblad centrifuge. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de OP50 pellet in steriel water en opnieuw pellet door centrifugeren. Twee keer Herhaal deze te wassen. </li><li> Na de tweede wasbeurt, verwijder zorgvuldig alle resterende water. Er mag geen water worden gelaten in de buis. Weeg de centrifugebuis met de pellet en aftrekken van het gewicht van de lege centrifugebuis om het gewicht van de pellet te bepalen. </li><li> Grondig resuspendeer de pellet in S-te voltooien tot een concentratie van 100 mg / ml. Geen klonten dient te worden overgelaten. </li><li> De concentratie van 100 mg / ml OP50 dienen te corresponderen met 2 x10 10 bacteriën / ml. Gebruik een foto spectrometer om het aantal bacteriën per ml te bepalen of de relatie tussen de optische dichtheid en het aantal bacteriën per ml is bekend. Indien nodig, de concentratie van de OP50 voeden oplossing voor 2 x10 10 bacteriën / ml. </li><li> Bewaar de OP50solution bij 4 ° C totdat het wordt gebruikt voor de worm cultuur. </li></ol> 2. De voorbereiding van een synchrone Worm Cultuur Deze paragraaf beschrijft de bereiding van de worm cultuur. Het doel is het genereren van een leeftijd-synchrone bevolking van wormen. Alle materialen die in contact komen met C.elegans na de behandeling bleekmiddel in stap 5 moeten steriel zijn. Platen zijn bewaard bij 20 ° C, tenzij anders aangegeven. Dag -6: vrijdag (week 1), 16u00: Transfer van de dieren om een nieuwe plaat <ol><li> Neem 5-10 dagen oud NGM plaat waarop de meerderheid van de worm bevolking bestaat uit uitgehongerd L1 larven. </li><li> Steriliseren een metalen spatel door kort te verwarmen boven een bunsenbrander. Laat het afkoelen. Gebruik de afgekoelde spatel te snijden agar stukken van het bord met de uitgehongerde wormen. Overdracht een aantal van deze brokken op een frisse 10 cm NGM plaat bezaaid met OP50. Incubeer ca.. 65 uur bij 20 ° C tot de meerderheid van de worm bevolking bestaat uit zwangere volwassenen. De tijd die het duurt voor de uitgehongerde L1 dieren uit te groeien tot zwangere volwassenen kan variëren van stam tot stam. </li></ol> Dag -3: maandag (week 2) 10:00: Opzetten van een synchrone bevolking <ol start="3"><li> Verzamel wormen uit de 10 cm plaat door ze te wassen van de plaat met 5-10 ml steriel water. Breng de worm / water-oplossing in een 15 ml conische buis. </li><li> Was de wormen door centrifugeren 2 min in een tafelblad centrifuge bij 1200 rpm (280 xg). Gooi supernatant en voeg 10 ml water. Herhalen. </li><li> Verwijder supernatant en voeg 5 ml vers bereide bleekwater / NaOH-oplossing (2,5 ml bleekmiddel, 1 ml NaOH 10N, 6,5 ml H 2 O). Incubeer gedurende 5 minuten bij RT tot de wormen open te breken. Zorg ervoor dat u voorzichtig vortex elke minuut. De voortgang van de reactie onder de microscoop te ontleden. </li><li> Zodra alle volwassenen te ontbinden, voeg 5 ml M9 buffer om de reactie te neutraliseren. </li><li> Was de eieren drie keer met 10 ml M9 buffer door het centrifugeren van 2 min bij 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Was de eieren een keer met 10 ml S-te voltooien door centrifugeren 2 min bij 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, voeg 10 ml S-compleet en breng de oplossing om een ​​nieuwe 50 ml conische buis. Voeg 30 ml van de S-te voltooien tot een uiteindelijk volume van 40 ml. Zachtjes schudden &#39;s nachts de buis bij kamertemperatuur op een nutator of soortgelijk apparaat. </li></ol> Dag -2: dinsdag (week 2), 12.00 uur: Zaad van de dieren in platen <ol start="10"><li> Onder het ontleden omvang, controleer dan of de wormen uitgekomen tijdens de nacht. Bepaal de concentratie van wormen in de S-complete oplossing door het tellen van het aantal wormen in 10 uL druppels met behulp van een dissectie scope. Tellen minstens 10 druppels voor elk monster. </li><li> Resuspendeer de wormen bij een concentratie van 80-100 wormen / ml in S-te voltooien. Voeg carbenicilline (stock 100 mg / ml) tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml en amfotericine B (stock 250 ug / ml) tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 ug / ml. Schudden op een nutator. Als voorbereiding grotere hoeveelheden van wormen, gebruik dan een 600 ml nunclon kolf met filter cap. </li><li> Op 14:30 voeg de OP50 bereid in deel 1 tot een uiteindelijke concentratie van 6 mg / ml (= 1,2 x10 9 bacteriën / ml). Zet de OP50 tot 4 ° C. </li><li> Overdracht 120 pi van de worm/OP50 oplossing in elk putje van een 96 wells plaat. Gebruik platen met 96 putjes met een transparante bodem. Zorg ervoor dat de wormen in suspensie te houden tijdens het pipetteren. </li><li> Seal de plaat met behulp van een tape sealer om besmetting en verdamping te voorkomen. Schud de plaat op een microtiterplaat shaker gedurende 2 minuten en incubeer gedurende 2 dagen bij 20 ° C tot de dieren bij de L4 stadium. </li></ol> Dag 0: donderdag (week 2) voor de middag: Steriliseer dieren door het toevoegen van Fluorodeoxyuridine (FUDR) <ol start="15"><li> Voor het steriliseren van de dieren toe te voegen 30 ul van een 0,6 mM FUDR stockoplossing aan elk putje. Deze stap brengt de uiteindelijke volume in elk putje tot 150 pi en vermindert de uiteindelijke concentratie van OP50 van 6mg / ml tot 5 mg / ml (1x10 9 bacteriën / ml). Seal de plaat met behulp van tape jagers en schud het 2-3 minuten op een microtiterplaat shaker. Als de OP50 werd toegevoegd om 2:30 op dag -2, is het belangrijk dat de FUDR is toegevoegd voor de middag. Keer terug platen om de 20 ° C incubator </li></ol> Dag 1: vrijdag (week 2): Voeg drugs aan cultuur <ol start="16"><li> 09:00 door het merendeel van de dieren worden zwangere en bevat een aantal eieren per stuk. Voeg de geneesmiddelen waarvan het effect op levensduur is te testen op de gewenste concentratie. Als het oplossen van de drugs in DMSO de eindconcentraties van DMSO mag niet meer dan 0,6%, zoals DMSO concentraties van meer dan 0,6% verkorten C.elegans levensduur. Na toevoeging van het geneesmiddel, sluit de platen met tape sealer en schud het 2-3 minuten op een microtiterplaat shaker. Keer terug platen om de 20 ° C incubator </li><li> Het toevoegen van de drugs af en toe kan doden een paar dieren per plaat, vooral bij gebruik van een oplosmiddel anders dan water. Gebruik een omgekeerde microscoop om te controleren op dode dieren. Over het algemeen moet er minder dan 10 dode dieren per 96 wells plaat. Keer terug platen om de 20 ° C incubator. </li></ol> Dag 4: maandag (week 3): Change jagers <ol start="18"><li> Toe te staan ​​verse zuurstof aan de cultuur gaan de sealer te verwijderen, wacht een minuut en sluit de plaat. Schud de plaat gedurende 2-3 minuten op een microtiterplaat shaker. Herhaal dit een keer per week. </li></ol> Dag 5: dinsdag (week 3): Voeg nieuwe OP50 aan uithongering te voorkomen <ol start="19"><li> Voeg 5 pi van de 100 mg / ml OP50-oplossing dat was in deel 1 bereid om elk van de 96 putten hongersnood te voorkomen. </li></ol> 3. Scoren van de levensduur. Deze paragraaf beschrijft hoe de overleving van de gesynchroniseerde worm bevolking van deel 2 wordt bewaakt totdat de dieren stierven. Te houden aan de dieren in de platen met 96 putjes, gebruik dan een omgekeerde microscoop met een 2x of 2,5 x doelstelling. Record overleving gegevens drie keer per week, maandag, woensdag en vrijdag. Gebruik beweging om te bepalen of de dieren worden levend of dood. Sterk licht, met name blauw licht, induceert de dieren te verplaatsen. Verwijder geen dode dieren uit de test. Af en toe kan dieren die niet bewoog en werden bepaald dood in de vorige telling gaan later. <ol><li> Op dag 0, tellen aan het begin van het experiment het totale aantal wormen in elk putje. Censor putten die meer dan 18 dieren uit de analyse bevatten als dieren in deze putten niet genoeg OP50 en zal effecten van calorische restrictie. </li><li> Om de kans dat de dieren te verplaatsen schudden de 96 wells plaat op een microtiterplaat shaker gedurende 2 minuten te verhogen. vóór het tellen. </li><li> In elke sessie tellen, record datum en het aantal dieren datbewegen als levende dieren. Beweging in een vloeistof is veel gemakkelijker dan op vaste media en kan worden geïnduceerd door sterke lampen. Het gebruik van een hogere vergroting kan helpen om heel subtiele bewegingen zoals die van de top van de keelholte plek. Dergelijke subtiele bewegingen zijn vaak de enige beweging waargenomen in zeer oude dieren. </li><li> Keer terug platen om de 20 ° C incubator </li><li> Herhaal stappen 2-4 om de twee tot drie dagen totdat alle dieren zijn dood. </li></ol> 4. Representatieve resultaten. In dit gedeelte wordt een voorbeeld van hoe een verslag van de levensduur gegevens die zijn gegenereerd door deze test en een aantal representatieve resultaten te houden. Figuur 1A toont een voorbeeld van hoe de levensduur gegevens vast te leggen tijdens deze test. Een Excel-sheet wordt gebruikt om bij te houden van het voortbestaan ​​van de populaties in elk putje. Voor elke goed het te coördineren in de plaat, stam, drugs, concentratie van het geneesmiddel en het totale aantal dieren leven op dag 0 (X0) is opgenomen aan het begin van het experiment. Record date, evenals het aantal levende en dode dieren drie keer per week, om het overleven van de verschillende bevolkingsgroepen in elk putje te volgen. De grafiek van de resultaten, het berekenen van de fractie van de dieren levend voor elke dag en plot als een functie van de tijd in dagen. P-waarden moeten worden berekend met behulp van statistische pakketten zoals STATA of vergelijkbare software. Het medium levensduur van C.elegans is afhankelijk van de temperatuur. Figuur 1B laat zien dat afhankelijk van de temperatuur veranderingen in de levensduur nauwkeurig worden gereproduceerd door de microtiterplaat op basis van levensduur test 22. Ook de microtiterplaat test reproduceert veranderingen in de levensduur van de mutanten gemeld levensduur die verschillen van de wild-type N2 dieren 23 tot 24 25 (afb. 1C) hebben. De test kan ook worden gebruikt om meer kwantitatieve uitspraken te doen. In Fig1D betekenen levensduur is uitgezet als een functie van de concentratie Mirtazepine 7. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de gemiddelde levensduur van 7-12 bevolking, die elk in een andere goed. Ook al is het aantal dieren per goed is relatief laag (5-15 dieren) van de well-to-well variatie is relatief klein kan worden afgeleid uit de fout bars. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. De microtiterplaat gebaseerd levensduur test reproduceert accuraat veranderingen in de levensduur in de literatuur. (A) Sample verzamelde gegevens in een Excel-spreadsheet. Tijdens elke sessie het tellen van de datum, de coördinatie van de put en het aantal levende en dode dier werd opgenomen. Aan het begin van het experiment, was het totale aantal dieren in elke goed bepaald. (B) Survival curve van wild-type (N2) dieren gegroeid bij 20 ° C en 25 ° C. (C) overlevingscurven van stammen met mutaties die levensduur beïnvloeden. Alle vier de stammen werden getest in parallel op 20 ° C. (D) Dosis-respons curve van Mirtazepine behandelde N2 dieren. De gemiddelde levensduur is uitgezet als een functie van de Mirtazepine concentratie. Foutbalken geven de SEM van 8 wells per conditie. 5. Materialen. M9 buffer, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 1000 ml </li><li> Autoclaaf </li></ul> Potassiumphosphate buffer pH 6,0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 900 ml </li><li> Pas de pH op 6.0 met 5M KOH </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 1000 ml </li><li> Autoclaaf </li></ul> Trace metal-oplossing <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g CuSO 4 </li><li> 1000 ml gedeïoniseerd water </li><li> Autoclaaf en op te slaan in het donker. </li></ul> S-basismedium, 1000 ml <ul><li> 5,9 g NaCl </li><li> 50 ml 1M kalium fosfaat, pH 6.0 </li><li> 1000 ml gedeïoniseerd water </li><li> Autoclaaf </li><li> Laat de oplossing afkoelen en voeg dan 1 ml van 5 mg / ml cholesterol (opgelost in Et-OH). </li></ul> Kaliumcitraat 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g tripotassium citraat </li><li> 26,3 citroenzuur monohydraat </li><li> Voeg 900 ml gedeïoniseerd water </li><li> Pas de pH op 6.0 met 5M KOH </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 1000 ml </li><li> Autoclaaf </li></ul> S-compleet medium, 1000 ml <ul><li> 977 ml S-basale </li><li> 10 mL 1M kaliumcitraat pH 6 (steriele) </li><li> 10 ml Trace metalen oplossing (steriel) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (steriele) </li><li> 3 mL 1M MgSO 4 (steriele) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3,0 g NaCl </li><li> 2,5 g pepton(Uit caseïne, alvleesklier verteren) </li><li> 17g Agar </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 975 ml en een roerstaaf </li><li> Autoclaaf </li><li> Na het autoclaveren afkoelen tot 55 ° C en voeg de volgende onderdelen: <ul><li> 0,5 ml van 1 M CaCl 2 (steriele) </li><li> 1 ml van 5 mg / ml Cholesterol in ethanol </li><li> 1 ml 1M MgSO 4 (steriele) </li><li> 25 mL Potassiumphosphate buffer, pH 6,0 (steriele) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Trypton </li><li> 24 g Gist Extract </li><li> 4 mL glycerol </li><li> Voeg 900 ml gedeïoniseerd water </li><li> Autoclaaf </li><li> Na het autoclaveren afkoelen tot 55 ° C en voeg de volgende component: <ul><li> Voeg 100 ml 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Los op in 670 ml steriele S-complete, maken 10 ml of 45 ml porties. </li><li> Bewaren bij -20 ° C. </li></ul> 100 mg / ml carbenicilline, 10 ml <ul><li> 1 g carbenicilline </li><li> 10 ml steriel gedeïoniseerd water </li><li> Steriel filtraat en aliquot </li><li> Bewaren bij -20 ° C. </li><li> Gebruik bij een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml </li></ul> 250ug / ml amfotericine B, 4 ml <ul><li> 1 mg amfotericine B </li><li> 4 ml Et-OH </li><li> Bewaren bij -20 ° C </li><li> Gebruik bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 ug / ml </li></ul>

<ol>
	<li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging.">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li><li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+ageing.">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li><li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+aging.">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li><li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans.">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span.">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li><li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li><li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans.">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans.">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li><li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans.">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li><li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li><li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK,+LKB1,+and+SKN-1.">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans.">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li><li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug.">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li><li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster.">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li><li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase/catalase+mimetics.">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li><li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan.">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li><li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+MPP++model+of+Parkinson's+disease+for+high-throughput+drug+screenings.">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li><li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li><li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+function+in+novel+targets:+C.+elegans+as+a+model+organism.">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

De gepresenteerde protocol maakt het meten van C.elegans levensduur in 96 goed microtiterplaten. Zoals getoond in de representatieve resultaten sectie is repliceert betrouwbaar eerdere bevindingen en geeft kwantitatieve informatie. Met behulp van deze test hebben we met succes meer dan 89.000 gescreende moleculen voor hun effect op C.elegans levensduur. Voor de toepassing van drug-screening, het meten van de levensduur in een 96 wells microtiterplaat formaat heeft verschillende voordelen ten opzichte van de klassieke vaste media assay. Het vermindert de arbeid die nodig is voor de media de voorbereiding, de hoeveelheid van incubatie ruimte, en de hoeveelheid van het geneesmiddel nodig is. De 96-well formaat en de microscopie setup mogelijk automatisering van de gehele test voor high throughput screening. Tijdens de ontwikkeling van de test meerdere waarden voor elke variabele en combinaties daarvan werden getest op hun effecten op C.elegans levensduur. Deze tests onder verschillende OP50 concentratie variërend van 3 tot 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), verschillend aantal wormen per well variërend van 7 tot 45 (7, 10, 15, 22, 45 wormen / well), andere cultuur volumes variërend van 40 tot 150 ul per putje (40, 60, 80, 100, 120, 150 pi), en veranderingen in de buffer samenstelling. Als je ze in met een carbenicilline-resistente OP50, noch carbenicilline of amfotericine B in de aangegeven concentraties bleken C.elegans levensduur beïnvloeden. Voortdurend zachtjes schudden van de platen, zoals vaak aanbevolen in C.elegans vloeibare cultuur, bleek overbodig voor de kleine volumes die in deze test. Zachtjes schudden is echter vereist als microtiterplaten met grotere putten worden gebruikt. De waarden die in dit protocol zijn zorgvuldig geselecteerd op basis van statistische vergelijking van de verschillende geteste condities. De meest verrassende kenmerk van deze test is waarschijnlijk het feit dat C.elegans kunnen worden bewaard in platen met 96 putjes die zijn afgedicht met tape. Side-by-side vergelijking is niet gebleken dat het verschil in levensduur van de dieren gekweekt in niet-gesloten platen, in platen afgedicht met een plastic sealer, of in platen afgedicht met jagers die uitwisseling van lucht mogelijk te maken. In alle drie de voorwaarden, de dieren ontwikkelde zich zeer homogeen van L1 aan zwangere volwassenen binnen 65 uur en toonde zeer vergelijkbaar zijn levensduur. Dieren gekweekt in parallel op NGM ontwikkeld iets sneller, maar dit verschil was onafhankelijk van de afwezigheid of aanwezigheid van een sealer. De gepresenteerde protocol is gebaseerd op levende bacteriën, maar kan worden aangepast voor dode bacteriën. Echter, in een vloeistof-test een enkele overlevende bacteriën kunnen zich snel vermenigvuldigen en opnieuw bevolken van de cultuur. In onze handen, de enige betrouwbare manier om bacteriën te doden in de mate dat ze kunnen worden gebruikt voor vloeibare cultuur wordt door langdurige behandeling van de bacteriën met gammastraling. Een belangrijk punt om te overwegen bij het plannen van een levensduur van experiment is de kracht van detectie. Afhankelijk van de grootte van het effect, moet het effect van het geneesmiddel van belang worden getest in meerdere putten. In een typische test 4 geneesmiddel behandeld en 4 controle putten, wat overeenkomt ruwweg op 40-50 dieren per stuk, moet voldoende zijn om een ​​30% toename van de levensverwachting in meer dan 95% van de experimenten op te sporen. Stijgt van 14% slechts aangetroffen in 60% van de gevallen en vereisen daarom meer repliceren putten. De rijkdom van de levensduur van gegevens die zijn gegenereerd door deze test kan worden gebruikt om te experimenteren ontwikkelen of stam specifieke parametrische Gompertz modellen 1. Deze Gompertz modellen zijn nuttig om de kracht van de opsporing te bepalen en om het aantal valse positieven en negatieven voor grootschalige schermen te schatten. We controleren de voorspellingen van deze modellen in blinde experimenten en gebruikte ze om het aantal valse negatieven in grote schermen (niet gepubliceerde resultaten) te schatten. Kortom, we verwachten dat de gepresenteerde analyse zal van groot nut om kleine moleculen die de levensduur van C.elegans uit te breiden en de onderliggende mechanismen studie te identificeren.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>cat# 171375</td>
<td>Also called Fungizone</td>
</tr>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat# F0503</td>
<td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td>
</tr>
<tr>
<td>Mianserin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>M2525-250MG</td>
<td>Use as positive control at 50&mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyproheptadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat#C6022-MG</td>
<td>Alternative positive control at 10 &mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 236370</td>
<td>Polyester, non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>96 well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>cat# 351172</td>
<td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 178883</td>
<td>used for large volumes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

Levensduur is een biologisch proces gereguleerd door verschillende genetische paden. Een strategie om de biologie van het ouder worden te onderzoeken is het bestuderen van dieren die haven van mutaties in componenten van de leeftijd-regelgevende paden. Als deze mutaties verstoren de functie van de leeftijd-regelgevende weg en dus veranderen de levensduur van het gehele organisme, ze belangrijke mechanistische inzichten 1-3. Een andere strategie om de regulering van levensduur te onderzoeken is om kleine moleculen te gebruiken om verstoren leeftijd regelgeving paden. Tot op heden zijn een aantal moleculen waarvan bekend is dat de levensduur te verlengen in verschillende modelorganismen en worden gebruikt als instrumenten om de biologie van veroudering 4-16 studie. Het aantal geïdentificeerde moleculen tot nu toe is klein in vergelijking met de genetische &quot;toolset&quot; die beschikbaar is voor de biologie van veroudering te bestuderen. Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modellen die gebruikt worden om te studeren veroudering omwille van zijn uitstekende genetica en korte levensduur van drie weken. Meer recent heeft C.elegans ontpopt als een modelorganisme voor fenotype based drug-schermen 5,7,16-20 vanwege zijn kleine formaat en de mogelijkheid om te groeien in microtiterplaten. Hier presenteren wij een test om te C.elegans levensduur te meten in 96 goed microtiterplaten. De test werd ontwikkeld en met succes gebruikt om grote bibliotheken scherm voor moleculen die C.elegans levensduur 7 uit te breiden. De betrouwbaarheid van de test werd geëvalueerd in meerdere tests: ten eerste, door het meten van de levensduur van de wild-type dieren gekweekt bij verschillende temperaturen, ten tweede, door het meten van de levensduur van de mutanten met gewijzigde levensduur, ten derde, door het meten van veranderingen in de levensduur in reactie op verschillende concentraties van het antidepressivum Mirtazepine. Mirtazepine al eerder is aangetoond dat de levensduur te verlengen C.elegans 7. De resultaten van deze tests tonen aan dat de test in staat is om eerdere bevindingen te repliceren van andere testen en is kwantitatief. De microtiterplaat formaat maakt ook deze levensduur test compatibel met geautomatiseerde liquid handling systemen en staat de integratie in geautomatiseerde platforms.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates at JoVE.com

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In dit protocol presenteren we een methode om te meten<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Levensduur in 96 goed microtiterplaten.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Het meten van replicatieve levensduur in de gist

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: Een methode voor het kweken Arabidopsis En tomatenplanten in 96-well platen voor high-throughput genotypering

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Het meten van oxidatieve stress Weerstand van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-well microtiterplaten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...