Name: measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates at JoVE.com

Detta protokoll utvecklades ursprungligen vid Fred Hutchinson Cancer Research Center i Seattle av Xiaolan Ye och Michael Petrascheck i laboratorium av Linda Buck. Den detaljerade versionen ovan har varit beredd att göra hela proceduren tillgängliga för samhället i stort. Vi tackar Carol Taylor, Sarah Leboeuf och Andy Tomacelli för kritiskt läsa protokollet. Detta manuskript # 2866 från The Scripps Research Institute. Den Petrascheck Lab finansieras av Novartis ADI-programmet.

Översikt: Protokollet är uppdelad i fyra delar. Del 1 beskriver hur man förbereder utfodring bakterier. Del 2 beskriver hur du förbereder masken kulturen. Del 3 beskriver hur man poäng livslängd. Del 4 visar några representativa resultat, och del 5 beskriver hur man kan förbereda de nödvändiga lösningarna. Livslängd experiment ta flera veckor att slutföra. För varje steg av protokollet veckan är dag och tid på dagen med för att underlätta planeringen. Den L4 scenen (Dag 0) används som referenspunkt för hela protokollet. 1. Beredning av Feeding Bakterier Detta avsnitt beskriver förberedelserna för utfodring bakterier. De specifika E. coli stam som används till foder C.elegans heter OP50. Före detta protokoll, för att förhindra korskontaminering av masken kultur med andra bakterier, har OP50 stammen gjorts Carbenicillin / ampicillinresistenta 21. Förbered OP50 fyra till fem dagar i förväg. Allt material som kommer i kontakt med OP50 måste vara sterila. Dag -7: torsdag (vecka 1): Inokulera 5 mL TB innehåller 100 mikrogram / ​​ml ampicillin och 0,1 mikrogram / ​​ml Amfotericin B med en enda OP50 koloni och inkubera över natten vid 37 ° C i en bakteriell shaker. Dag -6: fredag ​​(vecka 1). Morgon 8:30. Inokulera tidigt att ge tillräckligt med tid för kulturen att nå mättnad <ol><li> Späd natten kultur OP50 1:2000 i 300 ml TB innehåller 50 mikrogram / ml ampicillin. Inkubera kultur i en bakteriell shaker i 8-12 timmar vid 37 ° C tills mättnad är nådd. Låt inte kulturen att växa längre än 14 timmar. </li><li> Överför OP50 i en steril, pre-vägd centrifugering rör. Pelletera OP50 genom centrifugering i 10 min vid 3500 rpm (2200 xg) i en bordsskiva centrifug. </li><li> Kassera supernatanten och återsuspendera OP50 pelleten i sterilt vatten och re-pellet genom centrifugering. Upprepa tvätta två gånger. </li><li> Efter den andra tvätten, försiktigt ta bort alla kvarvarande vatten. Inget vatten bör vara kvar i röret. Väg centrifugeringen röret med pelleten och subtrahera vikten på den tomma centrifugering röret för att fastställa vikten av pelleten. </li><li> Grundligt återsuspendera pelleten i S-komplett till en koncentration av 100 mg / ml. Inga klumpar bör lämnas. </li><li> Den koncentration av 100 mg / ml OP50 bör motsvara 2 x10 10 bakterier / ml. Använd ett foto spektrometer för att bestämma antalet bakterier per ml om förhållandet mellan den optiska densiteten och antalet bakterier per ml är känd. Om nödvändigt, justera koncentrationen av OP50 utfodring lösningen på 2 x10 10 bakterier / ml. </li><li> Förvara OP50solution vid 4 ° C tills det används för masken kulturen. </li></ol> 2. Beredning av en synkron Worm Kultur Detta avsnitt beskriver förberedelserna av masken kulturen. Dess mål är att generera en ålder-synkron befolkning av maskar. Allt material som kommer i kontakt med C.elegans efter blekmedel behandlingen i steg 5 måste vara sterila. Plattorna hålls vid 20 ° C om inte annat anges. Dag -6: fredag ​​(vecka 1), 4:00 PM: Överför djur till en ny platta <ol><li> Ta en 5-10 dagar gammal NGM platta på vilken en majoritet av masken befolkning består av svalt L1 larver. </li><li> Sterilisera en metall spatel med kort uppvärmning den över en bunsenbrännare. Låt det svalna. Använd kyls spateln för att klippa ut agar bitar från plattan innehåller svalt maskar. Överföring flera av dessa bitar på ett nytt 10 cm NGM tallrik ympats med OP50. Inkubera i ca. 65 timmar vid 20 ° C tills de flesta av masken befolkning består av gravid vuxna. Den tid det tar för svalt L1 djuren att växa till gravida vuxna kan variera från stam till stam. </li></ol> Dag -3: måndag (vecka 2) 10:00 am: Upprätta en synkron befolkning <ol start="3"><li> Samla maskar från 10 cm tallrik genom att tvätta bort dem från plattan med 5-10 ml sterilt vatten. Överför masken / vatten lösning i en 15 ml konisk tub. </li><li> Tvätta maskar genom att centrifugera 2 min i en bordsskiva centrifugera vid 1200 rpm (280 xg). Kassera supernatanten och tillsätt 10 ml vatten. Upprepa. </li><li> Avlägsna supernatanten och tillsätt 5 ml nyberedd blekmedel / NaOH-lösning (2,5 ml blekmedel, 1 ml 10N NaOH, 6,5 ml H 2 O). Inkubera 5 minuter vid RT tills maskarna bryta. Var noga med att skaka försiktigt varje minut. Övervaka utvecklingen av reaktionen under dissekera mikroskop. </li><li> Så fort alla vuxna lösas upp, tillsätt 5 ml M9 buffert för att neutralisera den reaktionen. </li><li> Tvätta äggen tre gånger med 10 ml M9 buffert genom att centrifugera 2 min vid 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Tvätta äggen en gång med 10 ml S-komplett genom att centrifugera 2 min vid 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Avlägsna supernatanten, tillsätt 10 ml S-komplett och överför lösningen till ett nytt 50 ml koniska rör. Tillsätt 30 ml S-komplett till en slutlig volym på 40 ml. Skaka röret över natten i rumstemperatur på en nutator eller liknande anordning. </li></ol> Dag -2: tisdag (vecka 2), 12.00: Seed djuren i plattorna <ol start="10"><li> Enligt dissekera omfattning, kontrollera om maskar kläckts under natten. Bestäm koncentrationen av maskar i S-komplett lösning genom att räkna antalet maskar i 10 mikroliter droppar med en dissekera omfattning. Räkna med minst 10 droppar för varje prov. </li><li> Återuppslamma maskar i en koncentration av 80-100 maskar / ml i S-komplett. Lägg Carbenicillin (lager 100 mg / ml) till en slutlig koncentration på 50 mikrogram / ml och amfotericin B (lager 250 mikrogram / ml) till en slutlig koncentration på 0,1 mikrogram / ml. Skaka på en nutator. Om att förbereda större mängder av maskar, använd en 600 ml Nunclon kolv med filterlocket. </li><li> Vid 14:30 lägger OP50 upprättats i del 1 till en slutlig koncentration på 6 mg / ml (= 1,2 x10 9 bakterier / ml). Returnera OP50 till 4 ° C. </li><li> Överföring 120 mikroliter av worm/OP50 lösningen i varje brunn i en platta med 96 brunnar. Använd 96 brunnar med transparent botten. Se till att hålla maskarna i suspension under pipettering. </li><li> Täta plattan med hjälp av en tejp sealer för att undvika föroreningar och avdunstning. Skaka plattan på en mikrotiterplatta shaker i 2 min och inkubera i 2 dagar vid 20 ° C tills djuren når L4 scenen. </li></ol> Dag 0: torsdag (vecka 2) innan middagen: Sterilisera djur genom att lägga Fluorodeoxyuridine (FUDR) <ol start="15"><li> Att sterilisera djuren lägga 30 mikroliter av ett 0,6 mm FUDR stamlösning i varje brunn. Detta steg ger den sista volymen i varje brunn till 150 mikroliter och minskar den slutliga koncentrationen OP50 från 6 mg / ml till 5 mg / ml (1x10 9 bakterier / ml). Täta plattan med tejp tätningsmedel och skaka den i 2-3 min på en mikrotiterplatta shaker. Om OP50 inkom till 2:30 dag -2, är det viktigt att FUDR läggs före kl. Återgå tallrikar till 20 ° C inkubator </li></ol> Dag 1: fredag ​​(vecka 2): Lägg droger till kultur <ol start="16"><li> Genom 09:00 flesta av djuren bör gravida och innehåller flera ägg vardera. Tillsätt de läkemedel vars effekt på livslängd ska testas på önskad koncentration. Om upplösning av droger i DMSO den slutliga koncentrationer av DMSO inte överstiga 0,6%, som DMSO högre halter än 0,6% förkorta C.elegans livslängd. Efter tillägg av läkemedlet, försegla plattor med tejp sealer och skaka den i 2-3 min på en mikrotiterplatta shaker. Återgå tallrikar till 20 ° C inkubator </li><li> Lägga till droger kan ibland döda några djur per platta, speciellt om du använder ett lösningsmedel än vatten. Använd ett inverterat mikroskop för att kontrollera om döda djur. Generellt bör det vara mindre än 10 döda djur per 96 brunnar. Återgå tallrikar till 20 ° C inkubator. </li></ol> Dag 4: måndag (vecka 3): Ändra tätningsmedel <ol start="18"><li> För att möjliggöra ny syrgas att komma in i kulturen avlägsna förseglingen, vänta 1 minut och förslut plattan. Skaka plattan i 2-3 minuter på en mikrotiterplatta shaker. Upprepa en gång i veckan. </li></ol> Dag 5: Tisdag (vecka 3): Lägg till nya OP50 för att förhindra svält <ol start="19"><li> Tillsätt 5 mikroliter av 100 mg / ml OP50 lösning som har upprättats i del 1 till envar av de 96 brunnar för att förhindra svält. </li></ol> 3. Målgörare i livslängd. Detta avsnitt beskriver hur överlevnad synkroniserade masken befolkningen i del 2 skall övervakas tills djuren dog. För att observera djuren i 96 brunnar, använder ett inverterat mikroskop med en 2x eller 2.5x mål. Spela överlevnad uppgifter tre gånger i veckan, måndag, onsdag och fredag. Använd rörelse för att avgöra om djuren är levande eller döda. Starkt ljus, särskilt blått ljus, inducerar djuren att röra sig. Ta inte bort döda djur från analysen. Ibland kan djur som inte rör sig och var fast beslutna döda i föregående räkna flytta senare. <ol><li> På dag 0, i början av experimentet räknar det totala antalet maskar i varje brunn. Censurera brunnar som innehåller mer än 18 djur från den analys som djur i dessa brunnar kommer inte att ha tillräckligt OP50 och kommer att visa effekterna av dietrestriktioner. </li><li> För att öka chansen att djuren flyttas skaka 96 brunnar på en mikrotiterplatta shaker i 2 min. innan räkningen. </li><li> I varje räkna session avstämningsdag och antal djur somröra sig som levande djur. Rörelse i vätskan är mycket enklare än på fasta medier och kan framkallas av starkt ljus. Användningen av en högre förstoring kan hjälpa till att platsen är mycket subtila rörelser som de i toppen av svalget. Sådana subtila rörelser är ofta den enda rörelse som observerats i mycket gamla djur. </li><li> Återgå tallrikar till 20 ° C inkubator </li><li> Upprepa steg 2-4 varannan eller var tredje dag tills alla djur är döda. </li></ol> 4. Representativa resultat. Detta avsnitt visar ett exempel på hur man kan föra register över livslängden data som genereras av denna analys och några representativa resultat. Figur 1A visar ett exempel på hur du spelar in livslängden data under denna analys. Ett Excel-blad används för att hålla reda på överlevnad befolkningen i varje brunn. För varje bra det är koordinaten i plattan, (X0) stam, läkemedel, koncentration av läkemedlet och det totala antalet djur som lever på dag 0 registreras i början av experimentet. Avstämningsdag, liksom antalet levande och döda djur tre gånger i veckan för att följa överlevnaden av de olika populationer i varje brunn. Att plotta resultatet, beräkna hur stor del av djuren vid liv för varje dag och rita det som en funktion av tiden i dagar. P-värden skall beräknas med statistiska paket som STATA eller liknande programvara. Mediet livslängd C.elegans är temperaturberoende. Figur 1B visar att temperaturberoende förändringar i livslängd exakt återges av mikroteststrips baserat livslängd analys 22. Likaså återger mikrotiterplatta analysen förändringar i livslängd mellan mutanter rapporteras ha livslängd som skiljer sig från vilda djur typ N2 23-24 25 (fig 1c). Analysen kan också användas för att göra mer kvantitativa uttalanden. I Fig1D menar livslängd är inritad som en funktion av Mirtazepine koncentration 7. Varje datapunkt motsvarar den genomsnittliga livslängden på 7-12 befolkningen, varje levande i en annan väl. Även om antalet djur per brunn är relativt låg (5-15 djur) väl till brunnar variationen är relativt liten vilket kan ses från felstaplar. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Mikrotiterplatta bygger livslängd analys återger exakt förändringar i livslängd rapporterats i litteraturen. (A) Exempel på data som samlats in i ett Excel-ark. Under varje räkna session datum, samordna den väl och antalet levande och döda djur spelades in. I början av experimentet var det totala antalet djur i varje brunn bestäms. (B) Överlevnad kurva av vild typ (N2) djur växt vid 20 ° C och 25 ° C. (C) överlevnadskurvorna stammar bär mutationer som påverkar livslängden. Alla fyra stammar analyserades parallellt vid 20 ° C. (D) dosresponskurvan av Mirtazepine behandlade N2 djur. Genomsnittlig livslängd är inritad som en funktion av Mirtazepine koncentration. Felstaplar ange SEM av 8 brunnar per tillstånd. 5. Material. M9 buffert, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Tillsätt avjoniserat vatten till 1000 ml </li><li> Autoklav </li></ul> Potassiumphosphate buffert pH 6,0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Tillsätt avjoniserat vatten till 900 ml </li><li> Justera pH till 6,0 med 5M KOH </li><li> Tillsätt avjoniserat vatten till 1000 ml </li><li> Autoklav </li></ul> Spårmetaller lösning <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g CuSO 4 </li><li> 1000 ml avjoniserat vatten </li><li> Autoklav och förvara i mörker. </li></ul> S-bassubstratets, 1000 ml <ul><li> 5,9 g NaCl </li><li> 50 mL 1M kaliumfosfat, pH 6,0 </li><li> 1000 ml avjoniserat vatten </li><li> Autoklav </li><li> Låt lösningen svalna och tillsätt 1 ml 5 mg / ml kolesterol (löst i Et-OH). </li></ul> Kaliumcitrat 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g trikaliumitrat </li><li> 26,3 citronsyramonohydrat </li><li> Tillsätt 900 ml avjoniserat vatten </li><li> Justera pH till 6,0 med 5M KOH </li><li> Tillsätt avjoniserat vatten till 1000 ml </li><li> Autoklav </li></ul> S-komplett medium, 1000 ml <ul><li> 977 ml S-basala </li><li> 10 ml 1M kaliumcitrat pH 6 (steril) </li><li> 10 ml spårmetaller lösning (sterilt) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 3 ml 1M MgSO 4 (steril) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3,0 g NaCl </li><li> 2.5g Pepton(Kasein, pankreas smälta) </li><li> 17g Agar </li><li> Tillsätt avjoniserat vatten till 975 ml och en omrörning bar </li><li> Autoklav </li><li> Efter autoklavering svalna till 55 ° C och tillsätt följande komponenter: <ul><li> 0,5 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 1 ml 5 mg / ml Kolesterol i etanol </li><li> 1 mL 1M MgSO 4 (steril) </li><li> 25 mL Potassiumphosphate buffert, pH 6,0 (steril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Trypton </li><li> 24 g Jästextrakt </li><li> 4 ml Glycerol </li><li> Tillsätt 900 ml avjoniserat vatten </li><li> Autoklav </li><li> Efter autoklavering svalna till 55 ° C och lägg till följande komponenter: <ul><li> Tillsätt 100 ml 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mm Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma katt # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Lös upp i 670 ml sterilt S-klar, 10 ml eller 45 ml alikvoter. </li><li> Förvara vid -20 ° C. </li></ul> 100 mg / ml Carbenicillin, 10 ml <ul><li> 1 g Carbenicillin </li><li> 10 mL sterilt avjoniserat vatten </li><li> Sterila filtratet och delprov </li><li> Förvara vid -20 ° C. </li><li> Använd på en slutlig koncentration på 50 mikrogram / ml </li></ul> 250ug / ml Amfotericin B, 4 ml <ul><li> 1mg Amfotericin B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> Lagra vid -20 ° C </li><li> Använd till en slutlig koncentration av 0,1 mikrogram / ml </li></ul>

<ol>
	<li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging.">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li><li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+ageing.">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li><li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+aging.">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li><li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans.">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span.">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li><li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li><li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans.">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans.">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li><li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans.">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li><li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li><li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK,+LKB1,+and+SKN-1.">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans.">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li><li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug.">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li><li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster.">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li><li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase/catalase+mimetics.">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li><li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan.">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li><li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+MPP++model+of+Parkinson's+disease+for+high-throughput+drug+screenings.">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li><li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li><li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+function+in+novel+targets:+C.+elegans+as+a+model+organism.">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

Protokollet presenteras möjliggör mätning av C.elegans livslängden i 96 väl mikrotiterplattor. Som framgår av representativa resultat avsnittet replikerar den på ett tillförlitligt tidigare resultat och ger kvantitativ information. Med hjälp av denna analys har vi framgångsrikt visas över 89 tusen molekyler för deras effekt på C.elegans livslängd. För narkotika screening, mäta livslängden i ett 96 väl mikrotiterplatta formatet har flera fördelar jämfört med den klassiska fasta medier analys. Det minskar arbete som krävs för media förberedelse, mängden inkubation utrymme, och mängden läkemedel som behövs. Den 96-bra format och mikroskopi inställning tillåter automatisering av hela analysen för hög genomströmning visningar. Under utvecklingen av analysen flera värden för varje variabel och kombinationer av dessa testades för deras effekter på C.elegans livslängd. Dessa tester ingår olika OP50 koncentration mellan 3 till 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), olika antal maskar per brunn från 7 till 45 7 (, 10, 15, 22, 45 maskar / brunn), annan kultur volymer som sträcker sig från 40 till 150 mikroliter per brunn (40, 60, 80, 100, 120, 150 mikroliter), och förändringar i buffert sammansättning. Om matas med en Carbenicillin-resistent OP50, visade varken Carbenicillin eller amfotericin B vid koncentrationer befanns påverka C.elegans livslängd. Kontinuerlig varsam skakning av plattor, som ofta rekommenderas i C.elegans flytande kultur, hittades onödigt för små volymer som används i denna analys. Gentle skakar dock krävs om mikrotiterplattor med större brunnar som ska användas. De värden som anges i detta protokoll omsorgsfullt har valts ut baserat på statistisk jämförelse av de testade olika förhållanden. Det mest överraskande inslag i denna analys är förmodligen det faktum att C.elegans kan hållas i 96 brunnar som är förseglade med tejp. Side-by-side jämförelser visade inte någon skillnad i livslängd för djur odlade i oförseglade tallrikar, i plattor förseglas med en plast sealer, eller i form av plattor tätas med tätningsmedel som tillåter luftväxling. I alla tre villkor, utvecklade djuren är mycket homogent från L1 till gravida vuxna inom 65 timmar och visade mycket jämförbara livslängd. Djur odlas parallellt på NGM utvecklats något snabbare, men denna skillnad var oberoende av frånvaron eller närvaron av en sealer. Den presenterade Protokollet är baserat på levande bakterier, men kan anpassas för döda bakterier. Men i en vätska analys en enda överlevande bakterierna snabbt kan föröka sig och åter befolka kulturen. I våra händer är det enda tillförlitliga sättet att döda bakterier i den mån de kan användas för flytande kultur vid långvarig behandling av bakterier med gammastrålning. En viktig punkt att beakta vid planeringen av en livslängd experiment är kraften för upptäckt. Beroende på storleken på effekten måste effekten av läkemedlet av intresse att testas i flera brunnar. I ett typiskt test 4 läkemedelsbehandlade och 4 brunnar kontroll, vilket ungefär motsvarar 40-50 djur varje, borde räcka för att upptäcka en 30% ökning av livslängden i mer än 95% av försöken. Ökar med 14% bara detekteras i 60% av fallen och därför kräver mer replikera brunnar. Den mängd livslängd data som genereras av denna analys kan användas för att utveckla experiment eller stamspecifik parametriska Gompertz modeller 1. Dessa Gompertz modeller är användbara för att bestämma kraften för upptäckt och för att uppskatta antalet falska positiva och negativa för stora skärmar. Vi kontrollerade förutsägelser av dessa modeller i blind experiment och använde dem för att uppskatta antalet falskt negativa i stora skärmar (opublicerade resultat). Sammanfattningsvis räknar vi med att den presenterade analysen kommer att vara till stor nytta för att identifiera små molekyler som utökar livslängden hos C.elegans och studera bakomliggande mekanismer.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>cat# 171375</td>
<td>Also called Fungizone</td>
</tr>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat# F0503</td>
<td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td>
</tr>
<tr>
<td>Mianserin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>M2525-250MG</td>
<td>Use as positive control at 50&mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyproheptadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat#C6022-MG</td>
<td>Alternative positive control at 10 &mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 236370</td>
<td>Polyester, non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>96 well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>cat# 351172</td>
<td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 178883</td>
<td>used for large volumes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

Livslängd är en biologisk process regleras av flera olika genetiska vägar. En strategi för att undersöka åldrandets biologi är att studera djur som hamnen mutationer i delar av ålder-rättsliga vägar. Om dessa mutationer störa funktionen hos ålders-reglerande väg och därför förändra livslängden på hela organismen, ger de viktiga mekanistiska insikter 1-3. En annan strategi för att utreda regleringen av livslängd är att använda små molekyler för att störa ålder-rättsliga vägar. Hittills har ett antal molekyler kända för att förlänga livslängden på olika modellorganismer och används som verktyg för att studera åldrandets biologi 4-16. Antalet identifierade molekyler hittills är litet jämfört med den genetiska &quot;verktygen&quot; som är tillgänglig att studera åldrandets biologi. Caenorhabditis elegans är en av principen modeller som används för att studera åldrandet på grund av dess utmärkta genetik och kort livslängd på tre veckor. På senare tid har C.elegans framträtt som en modell organism för fenotyp baserade läkemedlet skärmar 5,7,16-20 på grund av sin ringa storlek och dess förmåga att växa i mikrotiterplattor. Här presenterar vi ett test för att mäta C.elegans livslängden i 96 väl mikrotiterplattor. Analysen har utvecklats och använts med framgång till skärmen stora bibliotek för molekyler som sträcker C.elegans livslängd 7. Tillförlitligheten i analysen har utvärderats i flera tester: dels genom att mäta livslängd vildtyp djur växt vid olika temperaturer, för det andra genom att mäta livslängd mutanter med förändrad livslängd, för det tredje, genom att mäta förändringar i livslängd som svar på olika koncentrationer av antidepressiva Mirtazepine. Mirtazepine har tidigare visat att förlänga livslängden i C.elegans 7. Resultaten av dessa tester visar att analysen kan replikera tidigare resultat från andra analyser och är kvantitativa. Den mikroteststrips formatet gör också denna livslängd analys kompatibel med automatiserade system vätskehantering och tillåter integration i automatiserade plattformar.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates at JoVE.com

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

I detta protokoll presenterar vi en metod för att mäta<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Livslängden i 96 väl mikrotiterplattor.

Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på 96 Tja mikrotiterplattor

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på fasta medier

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Kvantifiering Jäst Span Kronologisk Life av utväxt av Aged celler

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Mätning Span replikationsförmåga Livet i den spirande Jäst

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: En metod för odling Arabidopsis Och tomatplantor i 96-brunnar för high-throughput Genotypning

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Mätning Oxidativ stress Resistans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I 96-brunnars mikrotiterplattor

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Mätning ran peptid toxicitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Använda Caenorhabditis elegans för att screena för vävnadsspecifika förkläde interaktioner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...