Name: demonstrating the uses of the novel gravitational force spectrometer to stretch and measure fibrous proteins
Uploaded: 2011-03-19T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins at JoVE.com

Este material é baseado num trabalho apoiado pela National Science Foundation, Grant No. 0842736.

Introdução ao GFS Novel Configuração O GFS consiste de vários componentes essenciais: Um microscópio de luz comum, uma montagem equatorial, uma câmera e um computador [Figura 1]. A câmara de célula de fluxo selada que contém a amostra é também indispensável de acordo com o projeto GFS. O microscópio de luz é montado na montagem equatorial de modo que o escopo pode ser rodado em diferentes orientações no espaço. Esta capacidade permite que o vetor estático de gravidade para s...

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	<li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure.">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li><li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin.">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li><li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers.">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li><li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin's+50+kDa+cleft.">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li><li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+manipulating+individual+protein.">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li><li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments:+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin.">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li><li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment.">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li><li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer.">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li><li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface.">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li><li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy.">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li></ol>

Ao converter um filme para uma representação digital thresholded, é crucial para a imagem thresholded para manter a mesma área em cada quadro do vídeo. Porque as contas em um par de esferas se movem independentemente um do outro, qualquer desvio nas áreas thresholded também pode causar as distâncias relativas entre os centróides das contas à deriva e introduzir erros significativos. Controlar a área limite reduzido o erro de cinco vezes nas medidas distância de 26 nm até 5 nm. Também é crucial para obter ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Poly Sciences</td>
<td>919-30-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A18P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>110-86-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G7776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Organics</td>
<td>BP381-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>9682T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco</td>
<td>71289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>AMR-0332-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MSI</td>
<td>E9884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>60443</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-N Dimethyl Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracted from Large New </td>
<td>D4254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit skeletal myosin II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zealand White Rabbits (7-8)</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF30 antibody (9-10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies </td>
<td>MF30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF20 antibody (6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hybridoma Bank</td>
<td>MF20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boreal</td>
<td>WW57905M00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equatorial mount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Celestron</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital video cam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony</td>
<td>XCDV60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caliper release</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cabelas</td>
<td>IA-415482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compression spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co.</td>
<td>723</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extension spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co. </td>
<td>770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fire-i drivers &amp; application </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unibrain</td>
<td>3.80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Excel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microsoft</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

demonstrating the uses of the novel gravitational force spectrometer to stretch and measure fibrous proteins

O estudo da estrutura macromolecular tornou-se crítica para a elucidação dos mecanismos moleculares e função. Existem vários bio-instrumentos limitada, mas importante, capaz de testar a dependência força de características estruturais em proteínas. Escala tem sido um parâmetro limitante sobre a precisão pesquisadores podem perscrutar o mundo nanomechanical de moléculas, tais como ácidos nucléicos, enzimas e proteínas motoras que executam o trabalho de sustentação da vida. Microscopia de força atômica (AFM) é bem afinado para determinar estruturas de proteínas nativas fibroso com uma resolução distância a par com microscopia eletrônica. No entanto, em estudos AFM força, as forças são tipicamente muito maior do que uma única molécula poderá ter 1, 2. Armadilhas ópticas (OT) são muito bons em determinar a distância relativa entre as esferas de presos e que pode dar forças muito pequenas 3. No entanto, eles não rendem precisa comprimentos absoluta das moléculas em estudo. Simulações moleculares fornecem informações de suporte para tais experiências, mas são limitados na capacidade de lidar com os mesmos grandes tamanhos moleculares, prazos longos, e convencer alguns pesquisadores, na ausência de outras evidências 2, 4. A força gravitacional espectrómetro (GFS) preenche um nicho importante no arsenal de um investigador, oferecendo uma combinação única de habilidades. Este instrumento é capaz de gerar forças tipicamente com 98% ou maior precisão do intervalo femtonewton à gama nanonewton. As medições de distância atualmente são capazes de resolver o comprimento absoluto molecular até cinco nanômetros, e relativa distâncias par talão de separação com uma precisão semelhante a uma armadilha óptica. Além disso, o GFS pode determinar alongamento ou desenrolando onde a força está perto de equilíbrio, ou fornecer uma força de classificados de justapor contra qualquer medida mudanças estruturais. É ainda possível determinar quantas resíduos de aminoácidos estão envolvidos em eventos desenrolando sob cargas fisiológicas força 2. Ao contrário de outros métodos onde há força de calibração extenso que deve preceder qualquer ensaio, o GFS não requer calibração tal força 5. Complementando os pontos fortes de outros métodos, o GFS vai colmatar as lacunas na compreensão do nanomecânica de proteínas vitais e de outras macromoléculas.

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Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Este é um passo-a-passo mostrando o objetivo, funcionamento e resultados representativos do espectrômetro de força gravitacional romance.

Demonstrar os usos do Spectrometer Novel Força Gravitacional para esticar e Medida Proteínas fibrosas

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Crescimento Stretch: O Mecanotransdução do Crescimento Neuronal

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

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In situ compressão de carga e de imagem não invasivos Correlative do Osso-Ligamento periodontal de dentes fibrosa Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

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PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

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Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

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We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

Alta velocidade Spectrometer Sub-GHz para Brillouin Scattering Análise

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...