Name: high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00
Duration: 7 min 19 s
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Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Gyeong Chin, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Estève, Romualdas Vaisvila, laboratoire Steven E. Jacobsen s, UCLA. Ce travail a été partiellement financé par le NIH 1R44GM095209-01.

1. Glucosylation ADN et contrôler les réactions <ol><li> Dans un tube de réaction 1,5 millilitre sur la glace, mélanger microgrammes 5-10 de l&#39;ADN génomique (pour une concentration finale de 30 microgrammes / millilitre), 12,4 microlitres de l&#39;UDP-glucose (pour une concentration finale de 80 micromolaire), 31 microlitres de NEBuffer 4 et jusqu&#39;à 310 microlitres eau sans nucléase pour porter le volume total à 310 microlitres. </li><li> Fractionner ce mélange réactionnel dans deux tubes de 155 microlitres chacun. </li><li> Puis ajouter 30 unités, soit 3 microlitres, de T4-β-glucosyltransférase à un tube. Bien mélanger en douceur aspiration et refoulement. Le deuxième tube est la réaction de contrôle, donc ajoutez 3 microlitres d&#39;eau, au lieu de T4-BGT. </li><li> Incuber les deux tubes à 37 degrés Celsius pendant 12 à 18 heures, période pendant laquelle le T4-BGT va ajouter de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-hydroxyméthylcytosine groupes de l&#39;échantillon. </li></ol> 2. Digestion enzymatique de restriction <ol><li> Étiquette trois 0,2 millilitre PCR bande numéros 1 à 3 tubes. Aliquote de 50 ul du mélange réactionnel dans chaque. </li><li> Étiquette trois 0,2 millilitre PCR bande numéros tubes 4 à 6. Aliquote de 50 ul du mélange de contrôle dans chaque. </li><li> Ajouter 100 unités, soit 1 microlitre, des Mspl dans des tubes 1 et 4. Bien mélanger en douceur aspiration et refoulement. </li><li> Ajouter 50 unités, soit 1 microlitre de Hpall dans des tubes de 2 et 5. Bien mélanger en douceur aspiration et refoulement. </li><li> Ne pas ajouter quoi que ce soit à des tubes 3 et 6, car ils sont les témoins. </li><li> Incuber tous les tubes de 6 à 37 degrés Celsius pendant au moins 4 heures. </li><li> Ajouter 1 microlitre de la protéinase K dans chaque tube et incuber à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes. </li><li> Inactiver la protéinase K par une incubation à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. </li></ol> 3. Analyser l&#39;ADN par PCR / qPCR Ce protocole utilise ONÉ LongAmp Taq pour point final de PCR qui a été montré à bien performer. D&#39;autres protocoles de PCR peut être substitué. <ol><li> Ajouter les éléments suivants dans un tube de 0,2 ml PCR sur glace: 10 microlitres de tampon de réaction 5X LongAmp Taq, 1,5 microlitres de dNTP 10 mM, 1 microlitre de 10 amorce sens micromolaires, 1 microlitre de 10 amorce reverse micromolaires, 3 microlitres de template l&#39;ADN à partir des étapes précédentes, 1 microlitre de la polymérase Taq ADN LongAmp, et une eau sans nucléase jusqu&#39;à 50 microlitres. Ces volumes peuvent changer selon le protocole de PCR utilisées. </li><li> Mélanger délicatement la réaction. Si nécessaire, recueillir tout le liquide au fond du tube par un tour rapide. </li><li> Superposition de l&#39;échantillon avec de l&#39;huile minérale si vous utilisez un thermocycleur sans couvercle chauffant. </li><li> Transférer les tubes de PCR de la glace à un thermocycleur avec le bloc préchauffé à 94 degrés Celsius et démarrer le programme de cyclisme. Pour une routine 3-étape de PCR, il devrait y avoir une étape de dénaturation initiale à 94 degrés Celsius pendant 30 secondes, suivi par 30 cycles de 94 degré Celsius la dénaturation pendant 15 secondes, 55 à 65 degrés Celsius recuit pendant 30 secondes, et 65 degré Celsius d&#39;extension pendant 20 secondes ou 50 secondes par ko. Cela devrait être suivi par une extension finale à 65 degrés Celsius pendant 5 minutes. PCR en temps réel peut également être réalisée pour quantifier des quantités de 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine. S&#39;il vous plaît se référer à la notice du produit, trouvé sur neb.com pour des informations spécifiques. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Comparaison de la 5-hydroxyméthylcytosine sommes au locus 12 dans des échantillons de tissus de souris différents Balb / C. (A), point final de PCR. (B), PCR temps réel. L&#39;ADN à partir de quatre tissus de la souris a été analysée. Pour fins de comparaison, PCR en temps réel les données ont été normalisées à l&#39;ADN non coupé. Une courbe standard a été utilisé pour déterminer le nombre de copies. Les échantillons peuvent être normalisées en divisant le nombre de copies d&#39;échantillons Aucun 1-6 par le nombre de copies du contrôle qui est non digérées (no 5). Voies de gel Boxed montre la variation en 5-HMC présents.

<ol>
	<li>Sadri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li><li>Mathur, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene. 108, 1-6 (1991).</li><li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li></ol>

Ted et Romas, les auteurs de cet article, sont des employés de l&#39;ONÉ; Romas est le développeur principal de la trousse, avec Ted étant le directeur de la Direction du Développement Applications &amp; qui a supervisé le développement de ce kit.

Il ya plusieurs choses essentielles à considérer lors de la mise en place de cette expérience. Premièrement, il est important que le glucosylation d&#39;ADN génomique provenant d&#39;achèvement. La spécificité de séquence de T4-BGT n&#39;est pas connue, et il ne semble pas avoir le choix pour la séquence de substrat. Par conséquent, dans certains cas, les temps d&#39;incubation plus longue peut être nécessaire. Seconde digestion, Mspl et Hpall doit être complète afin d&#39;éviter un signal de fond. Pour ces enzymes de restriction, nous recommandons un temps d&#39;incubation de 4 heures, mais plus d&#39;incubations peuvent être réalisées lors clivage incomplet est observée. Troisièmement, le montant ADN d&#39;entrée peut être ajustée en fonction de la disponibilité, depuis le 20 END de l&#39;ADN peuvent être utilisés pour point final de PCR. Enfin, nous recommandons l&#39;utilisation de l&#39;ADN de contrôle fourni, qui peut être exécuté en parallèle avec l&#39;ADN génomique pour la 5-MC et 5-HMC quantification.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>EpiMark&trade; 5-hmC and 5-mC Analysis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>E3317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom per experiment; provided by user</td>
</tr>
<tr>
<td>LongAmp&reg; Taq DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0323</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N0447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>molecular biology grade water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue

Hydroxyméthylation ADN est une modification de l&#39;ADN connue depuis longtemps, mais est récemment devenu un foyer dans la recherche en épigénétique. L&#39;ADN des mammifères est enzymatiquement modifiés à la position du carbone 5 ème de la cytosine (C) aux résidus 5-MC, principalement dans le contexte des dinucléotides CpG. 5-MC se prête à l&#39;oxydation enzymatique de 5-HMC par la famille du Têt des enzymes, qui sont soupçonnés d&#39;être impliqués dans le développement et la maladie. Actuellement, le rôle biologique de 5-HMC n&#39;est pas entièrement comprise, mais suscite beaucoup d&#39;intérêt en raison de son potentiel en tant que biomarqueur. Cela est dû à plusieurs études novatrices d&#39;identification 5-hydroxyméthylcytosine chez la souris souches embryonnaires (ES) et les cellules neuronales. Les techniques de recherche, y compris les méthodes de bisulfite de séquençage, sont incapables de distinguer facilement entre 5-MC et 5-HMC. Quelques protocoles existent qui peuvent mesurer des montants globaux de la 5-hydroxyméthylcytosine dans le génome, dont la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ou chromatographie sur couche mince de nucléosides seule digéré de l&#39;ADN génomique. Les anticorps qui cible 5-hydroxyméthylcytosine existent également, qui peut être utilisé pour l&#39;analyse dot blot, immunofluorescence, ou à la précipitation d&#39;ADN hydroxyméthylés, mais ces anticorps n&#39;ont pas seule plus resolution.In de base, la résolution dépend de la taille de l&#39;ADN et pour immunoprécipité expériences biopuces, dépend de la conception de la sonde. Comme il ne sait pas exactement où 5-hydroxyméthylcytosine existe dans le génome ou de son rôle dans la régulation épigénétique, de nouvelles techniques sont nécessaires qui peuvent identifier hydroxyméthylation locus spécifique. Le EpiMark 5 HMC et 5-MC Analyse kit offre une solution de distinction entre ces deux modifications à des loci particuliers. Le EpiMark 5-HMC et analyse 5-MC Kit est une méthode simple et robuste pour l&#39;identification et la quantification de la 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine dans un locus d&#39;ADN spécifiques. Cette approche enzymatique utilise la sensibilité méthylation différentielle de l&#39;Mspl isoschizomères et Hpall dans un simple en 3 étapes du protocole. L&#39;ADN génomique d&#39;intérêt est traitée avec T4-TBG, l&#39;ajout d&#39;un moeity glucose à 5-hydroxyméthylcytosine. Cette réaction est indépendante de la séquence, donc tous les cinq-HMC sera glucosylés; non modifiés ou 5-MC ADN contenant ne sera pas affectée. Cette glucosylation est alors suivie d&#39;une digestion par endonucléase de restriction. Mspl et Hpall reconnaissent la même séquence (CCBG), mais sont sensibles à la méthylation états différents. Hpall clive seulement un site totalement non modifiée: toute modification (5-mC, 5-HMC ou 5-ghmC) soit à un clivage des blocs de cytosine. Mspl reconnaît et clive 5-MC et 5-HMC, mais pas 5 ghmC. La troisième partie de ce protocole est l&#39;interrogation du locus par PCR. Aussi peu que 20 ng d&#39;ADN d&#39;entrée peuvent être utilisés. Amplification de l&#39;expérimental (glucosylés et digéré) et de contrôle (maquette glucosylés et digéré) avec des amorces d&#39;ADN cible flanquant un site CCBG d&#39;intérêt (100-200 pb) est effectuée. Si le site contient des CpG 5-hydroxyméthylcytosine, une bande est détecté après glucosylation et la digestion, mais pas dans la réaction de contrôle non-glycosylées. PCR en temps réel donne une approximation de combien hydroxyméthylcytosine est dans ce site particulier. Dans cette expérience, nous allons analyser la quantité de 5 hydroxyméthylcytosine dans un échantillon de cerveau de souris Babl / C par PCR point final.

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High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Le EpiMark 5-HMC et le kit d&#39;analyse 5-MC peut être utilisé pour analyser et quantifier 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine au sein d&#39;un locus de SPE spécifiques. Le kit distingue 5-MC à partir de 5-HMC par l&#39;ajout de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-HMC via une réaction enzymatique utilisant β-glucosyltransférase (T4-TBG). Lorsque 5-HMC survient dans le contexte de la CCBG, cette modification convertit un site clivable Mspl à un site non clivable.

Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

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