Name: high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue at JoVE.com

Sriharsa Pradhan, שאנון מורי קיני, חכה צ&#39;ין Gyeong, Jurate Bitinaite, יו &#39;נג, פייר אוליבייה Esteve, Romualdas Vaisvila, מעבדה סטיבן א&#39; s ג&#39;ייקובסן, UCLA. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH 1R44GM095209-01.

1. ה-DNA Glucosylation בקרת תגובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור תגובה 1.5 למיליליטר על קרח, לערבב 50-10 מיקרוגרם של הדנ&quot;א הגנומי (ריכוז סופי של 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל), 12.4 מיקרוליטר של גלוקוז-UDP (ריכוז סופי של מיקרו 80), 31 מיקרוליטר של NEBuffer 4 עד 310 מיקרוליטר nuclease ללא מים להביא את הנפח הכולל עד 310 מיקרוליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול זה תערובת התגובה לשני צינורות של 155 מיקרוליטר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להוסיף 30 יחידות, או 3 מיקרוליטר, של T4-β-glucosyltransferase אל צינור אחד. מערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. הצינור השני הוא תגובה מלאה, אז להוסיף 3 מיקרוליטר של מים, במקום T4-BGT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שני צינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 18 שעות, במהלכן T4-BGT יוסיף גלוקוז לקבוצת הידרוקסיל של 5-hydroxymethylcytosine קבוצות המדגם. </li></ol> 2. אנזים הגבלה עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Three לייבל 0.2 למיליליטר PCR-רצועת צינורות המספרים 1 עד 3. 50 Aliquot ul של התערובת לתוך כל תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Three לייבל 0.2 למיליליטר PCR-רצועת צינורות מספרים 4 עד 6. 50 Aliquot ul של התערובת לתוך כל בקרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 יחידות, או 1 microliter, של MspI לתוך צינורות 1 ו -4. מערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 50 יחידות, או 1 microliter, של HpaII לתוך צינורות 2 ו -5. מערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תוסיף כלום צינורות 3 ו - 6, כפי שהם שולטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל 6 צינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 microliter של proteinase K לתוך הצינור כל לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית K proteinase ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol> 3. ניתוח ה-DNA על ידי ה-PCR / qPCR פרוטוקול זה משתמש LongAmp חוד של תקי עבור נקודת הסיום PCR אשר הוכח מתפקדים היטב. פרוטוקולים אחרים PCR ניתן להחליף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הרכיבים הבאים אל צינור 0.2 PCR התגובה למיליליטר על הקרח: 10 מיקרוליטר של הצפת התגובה 5X תקי LongAmp, 1.5 מיקרוליטר של 10 dNTPs millimolar, 1 microliter של מיקרו פריימר 10 קדימה, 1 microliter של פריימר 10 הפוך מיקרו, 3 מיקרוליטר של תבנית ה-DNA מן השלבים הקודמים, 1 microliter של פולימראז הדנ&quot;א תקי LongAmp ו nuclease ללא מים עד 50 מיקרוליטר. כרכים אלה עשויים להשתנות על פי פרוטוקול ה-PCR בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות את התגובה. במידת הצורך, לאסוף את כל נוזל אל החלק התחתון של הצינור על ידי ספין מהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי המדגם עם שמן מינרלי אם באמצעות thermocycler ללא מכסה מחומם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צינורות PCR מן הקרח thermocycler עם לחסום את שחומם מראש ל 94 מעלות צלזיוס להפעיל את תוכנית רכיבה על אופניים. עבור לשגרה 3-PCR צעד, לא אמורה להיות צעד אחד denaturation הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ואחריו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס denaturation למשך 15 שניות, 55-65 מעלות צלסיוס חישול למשך 30 שניות, ו - 65 מעלות צלסיוס הארכה למשך 20 שניות, או 50 שניות לכל kb. זו צריכה להיות מלווה הארכה אחת אחרונה ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בזמן אמת PCR ניתן גם לבצע כדי לכמת את הסכומים של 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine. עיין במדריך המוצר, נמצא על neb.com למידע ספציפי. </li></ol> 4. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. השוואה בין 5-hydroxymethylcytosine בסכומים מוקד 12 ב שונה Balb / C דגימות רקמות העכבר. (א), נקודת הסיום PCR. (ב), בזמן אמת PCR. ה-DNA מארבע רקמות העכבר נותח. לצורך ההשוואה, בזמן אמת PCR היו נתונים מנורמל ל-DNA נימול. עקומת סטנדרט היה בשימוש כדי לקבוע מספר עותק. הדגימות יכול להיות מנורמל על ידי חלוקת מספר עותק של דגימות לא 1-6 במספר עותק של שליטה כי הוא לא מעוכלים (לא 5). מסלול ג&#39;ל Boxed מראה וריאציה בהווה 5-HMC.

<ol>
	<li>Sadri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li><li>Mathur, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene. 108, 1-6 (1991).</li><li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li></ol>

גם טד בצוענים, המחברים של מאמר זה, הם עובדי חוד; בצוענים היא המפתחת העיקרית של הערכה, עם טד להיות מנהל מחלקת פיתוח יישומים אשר פיקח על פיתוח של הערכה זו.

יש דברים קריטיים מספר לשקול בעת הגדרת הניסוי הזה. ראשית, חשוב כי glucosylation של הדנ&quot;א הגנומי ממשיך סיום. סגוליות רצף של T4-BGT לא ידוע, וזה כנראה ברירה לרצף את המצע. לכן, במקרים מסוימים, פעמים הדגירה כבר עשוי להיות נחוץ. עיכול שנית, MspI ו HpaII חייב להיות שלם כדי למנוע אות הרקע. עבור אלה אנזימי הגבלה, אנו ממליצים זמן הדגירה של 4 שעות, אבל incubations כבר יכול להתבצע כאשר מחשוף שלם הוא ציין. שלישית, כמות ה-DNA קלט יכול להיות מותאם בהתאם לזמינות, מאז 20 NGS של דנ&quot;א יכולה לשמש נקודת הסיום PCR. לבסוף, אנו ממליצים על השימוש של ה-DNA לשלוט מסופק שניתן להריץ במקביל הדנ&quot;א הגנומי של 5-MC ו-5-HMC כימות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>EpiMark&trade; 5-hmC and 5-mC Analysis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>E3317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom per experiment; provided by user</td>
</tr>
<tr>
<td>LongAmp&reg; Taq DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0323</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N0447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>molecular biology grade water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue

Hydroxymethylation DNA הוא שינוי יודעים מזה זמן רב של ה-DNA, אך הפכה לאחרונה מוקד מחקר epigenetic. ה-DNA הוא שונה היונקים enzymatically במיקום פחמן 5 th של ציטוזין (C) שאריות עד 5-MC, ברובה בהקשר של dinucleotides CPG. 5-MC ניתנת חמצון אנזימטי עד 5-HMC ידי משפחת ט של אנזימים, אשר הם האמינו להיות מעורב בפיתוח ומחלות. נכון לעכשיו, התפקיד הביולוגי של 5-HMC לא מובנת לחלוטין, אך הוא יצירת עניין רב בשל הפוטנציאל שלה בתור סמן. זאת עקב מחקרים פורצי מספר זיהוי 5-hydroxymethylcytosine בעכבר גזע עובריים (ES) ותאי עצב. שיטות מחקר, כולל שיטות bisulfite רצף, אינם מסוגלים להבחין בקלות בין 5-5-MC ו HMC. קיימים מספר פרוטוקולים שניתן למדוד כמויות גלובלית של 5-hydroxymethylcytosine בגנום, כולל כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה or כרומטוגרפיה שכבה דקה של נוקלאוזידים יחיד מתעכל מ-DNA הגנומי. נוגדנים המכוונים 5-hydroxymethylcytosine גם קיים, אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח כתם נקודה, immunofluorescence, או משקעים של ה-DNA hydroxymethylated, אבל נוגדנים אלה אין תוספת יחיד resolution.In בסיס, ברזולוציה תלוי בגודל של ה-DNA immunoprecipitated ועבור ניסויים microarray, תלוי בעיצוב בדיקה. מאז לא ידוע היכן בדיוק 5-hydroxymethylcytosine קיים בגנום או תפקידה תקנה epigenetic, טכניקות חדשות נדרשים שניתן לזהות hydroxymethylation מוקד ספציפי. EpiMark 5-5-HMC ו MC ניתוח Kit מספקת פתרון להבחנה בין שני שינויים ב לוקוסים ספציפיים. EpiMark 5-5-HMC ו MC ניתוח Kit היא שיטה פשוטה וחזקה לזיהוי ו quantitation של 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד DNA ספציפיים. גישה זו האנזימטית מנצל את ההפרש מתילציה הרגישות של MspI isoschizomers ו HpaII בפרוטוקול 3 שלבים פשוטים. הדנ&quot;א הגנומי של הריבית שטופלו T4-BGT, הוספת moeity הגלוקוז 5-hydroxymethylcytosine. תגובה זו רצף עצמאית, ולכן כל 5-HMC יהיה glucosylated, ללא שינוי או 5-MC-DNA המכיל לא יושפעו. Glucosylation זה לאחר מכן על ידי עיכול endonuclease הגבלה. MspI ו HpaII להכיר אותו רצף (CCGG), אך רגישים מתילציה מדינות שונות. HpaII cleaves רק באתר ללא שינוי לחלוטין: כל שינוי (5-MC, 5-HMC או 5-ghmC) בשעה מחשוף או בלוקים ציטוזין. MspI מזהה cleaves 5-MC ו-5-HMC, אך לא 5-ghmC. החלק השלישי של הפרוטוקול הוא חקירתו של מוקד על ידי PCR. משהו כמו 20 ng של DNA קלט ניתן להשתמש. הגברה של הניסוי (glucosylated ו מעוכל) שליטה (מדומה glucosylated ו מעוכל) DNA היעד עם primers איגוף אתר CCGG עניין (100-200 נקודות בסיס) מבוצע. אם האתר מכיל 5-CPG hydroxymethylcytosine, להקה מזוהה לאחר glucosylation ועיכול, אך לא התגובה הלא glucosylated הבקרה. זמן אמת PCR ייתן אומדן של כמה hydroxymethylcytosine נמצא באתר מיוחד זה. בניסוי זה, ננתח את כמות 5-hydroxymethylcytosine במדגם עכבר Babl / C המוח על ידי נקודת הסיום PCR.

Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue at JoVE.com

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

EpiMark 5-5-HMC ו MC ערכת ניתוח יכול לשמש כדי לנתח לכמת 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד spe cific. הערכה מבדיל 5-MC מתוך 5-HMC על ידי תוספת של גלוקוז אל קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC דרך התגובה האנזימטית ניצול β-glucosyltransferase (T4-BGT). כאשר 5-HMC מתרחשת בהקשר של CCGG, שינוי זה ממיר אתר cleavable MspI לאתר הלא cleavable.

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

ניתוח metabolomic של מוח חולדה על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית הגרעינית ברזולוציה גבוהה של תמציות רקמות

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...