Name: high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00
Duration: 7 min 19 s
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Sriharsa Pradhan, 섀넌 모리 키니, 잠시 만요 경인 친, Jurate Bitinaite, 유 청, 피에르 올리비에 Esteve, Romualdas Vaisvila, 스티븐 E. 야콥센의 연구소, UCLA. 이 작품은 부분적으로 NIH 1R44GM095209 - 01에 의해 지원되었다.

1. DNA의 Glucosylation 및 제어 반응 <ol><li> 얼음 1.5 밀리리터 반응 관에서 게놈 DNA의 50-10 마이크로 그램 (30 마이크로 그램 / 밀리리터의 최종 농도의 경우), UDP - 포도당의 12.4 microliters (80 micromolar의 최종 농도에 대한) NEBuffer 4 31 microliters를 섞어 및 최대 310 microliters nuclease - 무료 물 310 microliters로 전체 볼륨을 가지고 있습니다. </li><li> 155 microliters 각각 두 개의 튜브에이 반응 혼합물을 분리. </li><li> 어느 튜브에 T4 - β - glucosyltransferase 30 단위, 또는 3 microliters를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다. 두 번째 관 제어 반응이기 때문에 대신 T4 - BGT의, 물 3 microliters를 추가합니다. </li><li> T4 - BGT이 예제에서 5 hydroxymethylcytosine 그룹의 수산기 그룹에 포도당을 추가되는 기간 동안 12 ~ 18 시간 동안 섭씨 37도에서 모두 튜브를 품어. </li></ol> 2. 제한 효소 분해 <ol><li> 레이블 세 0.2 밀리리터 PCR - 스트립 튜브 번호 3 1. 각각에 반응 혼합물의 나누어지는 50 UL. </li><li> 레이블 세 0.2 밀리리터 PCR - 스트립 튜브 번호 4-6. 각각으로 제어 혼합물의 나누어지는 50 UL. </li><li> 튜브 1 사에 MspI의 100 단위 또는 1 microliter를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다. </li><li> 튜브 2와 5로 HpaII 50 단위 또는 1 microliter를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다. </li><li> 그들이 통제하는 한 튜브 3 6 아무것도 추가하지 마십시오. </li><li> 최소한 4 시간 동안 섭씨 37도에서 모두 6 튜브를 품어. </li><li> 각각의 튜브에 Proteinase K 1 microliter를 추가하고 30 분 섭씨 40도에서 알을 품다. </li><li> 10 분 섭씨 95 도에 잠복기로 Proteinase K를 Inactivate. </li></ol> 3. PCR / qPCR에 의해 DNA를 분석 이 프로토콜은 잘 수행하기 위해 표시되었습니다 엔드 포인트 PCR을위한 코의 LongAmp DNA 형성 촉매를 사용합니다. 기타 PCR 프로토콜을 대체하실 수 있습니다. <ol><li> 배 LongAmp DNA 형성 촉매 반응 버퍼, 10 millimolar dNTPs, 10 micromolar 앞으로 프리머 1 microliter, 10 micromolar 리버스 프라이머 1 microliter, 템플릿 3 microliters 1.5 microliters 10 microliters : 얼음 0.2 밀리리터 PCR 반응 관에 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 이전 단계 LongAmp DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 1 microliter, 그리고 nuclease없는 물을 최대 50 microliters부터 DNA. 이러한 볼륨이 사용되는 PCR 프로토콜에 따라 변경될 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 반응을 섞는다. 필요한 경우, 빠른 스핀에 의해 튜브의 바닥에 모든 액체를 수집합니다. </li><li> 온수 뚜껑없이 thermocycler를 사용하는 경우에는 미네랄 오일 샘플을 중첩. </li><li> 섭씨 94 도까지 preheated 블록과 얼음 thermocycler로 PCR 튜브를 전송하고 자전거 프로그램을 시작합니다. 일상적인 3 단계 PCR의 경우, 15 초 동안 변성 섭씨 94도 30주기, 30 초 동안 풀림 섭씨 55-65도, 및 확장 섭씨 65도 다음에 30 초 동안 섭씨 94 도로 한 초기 변성 단계 있어야 20초 또는 킬로바이트 50 초. 이것은 5 분 섭씨 65 도에 마지막으로 확장하여 다음해야합니다. 실시간 PCR은 또한 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine의 금액을 quantitate을 수행할 수 있습니다. 구체적인 내용을 neb.com에있는 제품 매뉴얼을 참조하십시오. </li></ol> 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 다른 마우스 Balb / C 조직 샘플에서 로커스 12 5 hydroxymethylcytosine 금액의 비교. (A), 엔드 포인트 PCR. (B), 실시간 PCR. 네 마우스 조직에서 DNA 분석했다. 비교 목적을 위해 실시간 PCR 데이터를 삭제하지 않은 DNA에 정상화되었다. 표준 곡선은 사본 번호를 결정하는 데 사용되었다. 샘플은 소화되지 않은있는 컨트롤의 복사본 번호 (없음 5)에 의해 시료 없음 1-6의 사본 번호를 나누어 정상화 수 있습니다. 박스 겔 레인 5 HMC 선물의 편차를 보여줍니다.

<ol>
	<li>Sadri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li><li>Mathur, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene. 108, 1-6 (1991).</li><li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li></ol>

테드와 Romas 모두는이 문서의 저자는 코의 직원되며 Romas 테드이 키트의 개발을 감독 응용 프로그램 및 개발 부서의 이사 있기 때문에 키트의 주요 개발자입니다.

본 실험을 설정할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 것들이 있습니다. 첫째, 게놈 DNA의 glucosylation 끝까지 진행하는 것이 중요합니다. T4 - BGT의 시퀀스 특이성이 알려져 있으며 그것은 기판 시퀀스에 대한 선택의 여지가 없어 보인다되지 않습니다. 따라서, 어떤 경우에, 더 이상 부화 시간이 필요할 수 있습니다. 둘째, MspI 및 HpaII 소화 배경 신호를 방지하기 위해 완료해야합니다. 이러한 제한 효소의 경우, 우리는 4 시간 배양 시간을 권장하지만, 불완전 절단이 관찰되면 더 이상 incubations을 수행할 수 있습니다. 셋째, 입력 DNA 금액은 DNA의 20 ngs는 엔드 포인트 PCR에 사용할 수 있기 때문에, 상황에 따라 조정할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 5 - MC 5 - HMC의 부량에 대한 게놈 DNA와 병렬로 실행할 수 있습니다 공급 제어 DNA의 사용을 권장합니다.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>EpiMark&trade; 5-hmC and 5-mC Analysis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>E3317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom per experiment; provided by user</td>
</tr>
<tr>
<td>LongAmp&reg; Taq DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0323</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N0447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>molecular biology grade water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue

DNA의 hydroxymethylation은 DNA의 긴 알려진 수정이지만, 최근 epigenetic 연구의 초점이되었다. 포유 동물 DNA는 효소 predominately CPG dinucleotides의 맥락에서, 5 MC로 사이 토신 (C) 잔류물의 5 번째 탄소 위치에 수정됩니다. 5 MC 개발과 질병에 관련된 것으로 아르 효소의 Tet 가족에 의해 5 HMC에 효소 산화 의무가 있습니다. 현재, 5 - HMC의 생물 학적 역할은 완전히 이해되지 않지만 biomarker로서의 가능성 때문에 많은 관심을 생성합니다. 이것은 마우스 배아 줄기 (ES)와의 연결을 세포에서 5 hydroxymethylcytosine을 식별하는 몇 가지 획기적인 연구로 인해 발생합니다. bisulfite 시퀀싱 방법을 포함한 연구 기술, 쉽게 5 MC 5 - HMC를 구분할 수 없습니다. 몇 가지 프로토콜은 질량 분광법 분석이나 게놈 DNA의 소화 단일 nucleosides의 얇은 층 크로마 토그래피 액체 크로마 토그래피와 결합을 포함한 게놈의 5 hydroxymethylcytosine의 글로벌 양을 측정할 수 존재한다. 도트 얼룩 분석, immunofluorescence, 또는 hydroxymethylated DNA의 침전에 사용될 수 있지만, 이러한 항체가 하나의 기본 resolution.In 추가이없는 대상 5 hydroxymethylcytosine도 존재한다는 항체, 해상도는 immunoprecipitated DNA의 크기와에 대한 의존 microarray 실험이 프로브 디자인에 따라 달라집니다. 그것이 5 hydroxymethylcytosine은 epigenetic 규제의 게놈 또는 역할 존재 정확한 위치를 알 수 있기 때문에, 새로운 기술은 특정 로커스 hydroxymethylation을 식별할 수있는 필요합니다. EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 특정 loci에서 두 수정 구별을위한 솔루션을 제공합니다. EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트 5 methylcytosine 및 특정 DNA를 로커스 내에서 5 - hydroxymethylcytosine의 식별 및 quantitation를위한 간단하고 강력한 방법입니다. 이 효소 접근 방식은 간단한 3 단계 절차에서 isoschizomers MspI과 HpaII의 차동 methylation 감도를 사용합니다. 관심 게놈 DNA는 5 hydroxymethylcytosine에 포도당 moeity를 추가 T4 - BGT와 함께 처리됩니다. 이 반응은 순서대로 독립적인, 따라서 모든 5 HMC이 glucosylated됩니다; 수정되지 않은 또는 5 - MC 포함된 DNA가 영향을받지 않습니다. 이 glucosylation는 다음 제한 endonuclease는 소화옵니다. MspI 및 HpaII 같은 순서 (CCGG)를 인식하지만 다른 methylation 상태에 민감합니다. 사이 토신 차단 절단 중 언제든지 변경 (5 - MC, 5 - HMC 또는 5 GHMC) : HpaII은 완전히 수정되지 않은 사이트를 클리브스. MspI 5 - MC 5 - HMC 아니지만 5 GHMC를 인식하고 클리브스. 프로토콜의 세 번째 부분은 PCR에 의한 로커스의 심문이다. 입력 DNA의 조금은 20 NG를 사용할 수 있습니다. 실험 (glucosylated와 소화) 및 제어 (모의은 glucosylated와 소화) 관심 CCGG 사이트 (100-200 BP)를 측면 primers와 대상의 DNA 증폭이 수행됩니다. CPG 사이트 5 hydroxymethylcytosine 포함되어있는 경우 밴드가 glucosylation과 소화 후에 감지 아니지만 비 glucosylated 제어 반응 인치입니다 실시간 PCR은 hydroxymethylcytosine이 특정 사이트에 얼마나의 근사치를 제공합니다. 본 실험에서는, 우리는 엔드 포인트 PCR에 의한 마우스 Babl / C 뇌 샘플에서 5 hydroxymethylcytosine 금액을 분석합니다.

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High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

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