Name: high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue at JoVE.com

Sriharsa Прадхан, Шеннон Мори Кинни, Hang Gyeong Чин, Юрате Bitinaite, Ю. Чжэн, Пьер Оливье Esteve, Ромуальдас Vaisvila, лабораторные Стивен Э. Якобсен с, Лос-Анджелесе. Эта работа была частично поддержана NIH 1R44GM095209-01.

1. Glucosylation ДНК и контроля реакции <ol><li> В 1,5 мл реакционной трубы на лед, перемешать 5-10 мкг геномной ДНК (для конечной концентрации 30 мкг / мл), 12,4 мкл UDP-глюкозы (для конечной концентрации 80 мкмоль), 31 мкл NEBuffer 4 и до 310 мкл нуклеазы без воды довести общий объем до 310 мкл. </li><li> Сплит этой реакционной смеси на две трубы из 155 мкл каждого из них. </li><li> Затем добавить 30 единиц, или 3 мкл, Т4-β-glucosyltransferase к одной трубке. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз. Вторая трубка контрольной реакции, так что добавьте 3 мкл воды, вместо того, Т4-BGT. </li><li> Инкубируйте обе трубки на 37 градусов по Цельсию в течение 12 до 18 часов, в течение которых Т4-BGT добавят глюкозы гидроксильные группы 5-hydroxymethylcytosine групп в образце. </li></ol> 2. Пищеварение рестрикции <ol><li> Этикетка три 0,2 мл ПЦР-полосы трубы цифры от 1 до 3. Алиготе 50 мкл реакционной смеси в каждую. </li><li> Этикетка три 0,2 мл ПЦР-полосы трубы номера с 4 по 6. Алиготе 50 мкл контроля смесь в каждом. </li><li> Добавить 100 единиц, или на 1 мкл, из MspI в пробирки 1 и 4. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз. </li><li> Добавить 50 единиц, или на 1 мкл, из HpaII в пробирки, 2 и 5. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз. </li><li> Не добавляйте ничего, чтобы трубы 3 и 6, так как они являются элементами управления. </li><li> Инкубируйте всех 6 труб при температуре 37 градусов по Цельсию в течение не менее 4 часов. </li><li> Добавить 1 мкл протеиназы К в каждую пробирку и инкубировать при температуре 40 градусов по Цельсию в течение 30 минут. </li><li> Инактивировать протеиназы К путем инкубации при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут. </li></ol> 3. Анализ ДНК методом ПЦР / КПЦР Этот протокол использует NEB в LongAmp Taq для конечной точки ПЦР, который был проявлен к хорошей работе. Другие протоколы ПЦР могут быть заменены. <ol><li> Добавьте следующие компоненты в 0,2 мл ПЦР-реакции пробирку на льду: 10 мкл 5X LongAmp Taq реакционного буфера, 1,5 мкл 10 мМ дНТФ, 1 мкл 10 мкмоль прямого праймера, 1 мкл 10 мкмоль Primer назад, 3 мкл шаблон ДНК из предыдущих шагов, 1 микролитр LongAmp ДНК-полимеразы Taq и нуклеазы без воды до 50 мкл. Эти объемы могут меняться в зависимости от используемого протокола ПЦР. </li><li> Аккуратно перемешайте реакции. При необходимости собрать все жидкости в нижней части трубы быстро вращаться. </li><li> Наложение образца с минеральным маслом при использовании амплификаторе без подогревом крышкой. </li><li> Передача пробирки для ПЦР изо льда в Термоциклер с блока предварительно нагретую до 94 градусов по Цельсию и начать езда на велосипеде программы. Для рутинной 3-х ступенчатый ПЦР, должен быть один первый шаг денатурации при 94 градусах Цельсия в течение 30 секунд, затем 30 циклов 94 градусов Цельсия денатурации в течение 15 секунд, от 55 до 65 градусов Цельсия отжига в течение 30 секунд, и 65 градусов по Цельсию расширение в течение 20 секунд, или 50 секунд кб. Это должно сопровождаться одним последним продлением на 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут. ПЦР в реальном времени также может быть выполнена для количественного определения количества 5-метилцитозин и 5-hydroxymethylcytosine. Пожалуйста, ознакомьтесь с руководством по продукции, найденный на neb.com конкретной информации. </li></ol> 4. Представитель Результаты: <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Сравнение 5-hydroxymethylcytosine суммы в локусе 12 в другую мышь Balb / C образцы тканей. (А), конечного точки ПЦР. (B), ПЦР в реальном времени. ДНК из четырех тканях мышей были проанализированы. Для сравнения, ПЦР в реальном времени данные были нормированы на режиссерский ДНК. Стандартная кривая была использована для определения количества копий. Образцы могут быть нормализованы путем деления количества копий образцов не по 1-6 числа копий управления, непереваренные (№ 5). Штучной упаковке полосы геля показано изменение в 5-HMC настоящее время.

<ol>
	<li>Sadri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li><li>Mathur, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene. 108, 1-6 (1991).</li><li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li></ol>

Оба Тед и цыгане, авторы этой статьи, являются сотрудниками NEB; рома является главным разработчиком комплекта, с Тедом будучи директором Приложения и департамента развития, который курировал разработку этого набора.

Есть несколько важных вещей, чтобы рассмотреть при создании этого эксперимента. Во-первых, важно, чтобы glucosylation геномной ДНК переходит к завершению. Последовательность Специфичность Т4-BGT не известно, и это, кажется, нет другого выбора, для подложки последовательности. Поэтому в некоторых случаях более длительное время инкубации может быть необходимым. Во-вторых, MspI и HpaII пищеварения должна быть полной, чтобы избежать фонового сигнала. Для этих ферментов рестрикции, мы рекомендуем инкубации в течение 4 часов, но больше инкубации могут быть выполнены при неполном расщеплении наблюдается. В-третьих, количество входных ДНК может быть скорректирован в зависимости от доступности, с 20 NGS ДНК может быть использована для конечной точки ПЦР. Наконец, мы рекомендуем использовать поставляемые контроль ДНК, которые могут работать параллельно с геномной ДНК в течение 5-MC и 5-HMC количественной оценке.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>EpiMark&trade; 5-hmC and 5-mC Analysis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>E3317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom per experiment; provided by user</td>
</tr>
<tr>
<td>LongAmp&reg; Taq DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0323</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N0447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>molecular biology grade water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells. Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol. Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected. This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC. The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site. In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue at JoVE.com

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

EpiMark 5-HMC и 5-тС Анализ Kit может быть использован для анализа и количественного 5-метилцитозин и 5-hydroxymethylcytosine в специально cific локуса. Комплект отличается 5-тС из 5-HMC добавлением глюкозы в гидроксильные группы 5-HMC через ферментативной реакции использованием β-glucosyltransferase (Т4-BGT). Когда 5-HMC происходит в контексте КСДУ, эта модификация превращает расщепляемого сайт MspI к не-расщепляемого сайта.

Высокая чувствительность 5-hydroxymethylcytosine Обнаружение в Balb / C ткани мозга

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Быстрое подход к высоким разрешением флуоресценции в Semi-ломтики толщиной мозга

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Обнаружение белка Palmitoylation в культуре нейронов гиппокампа на Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Метаболомики Анализ мозга крысы путем высокого разрешения ядерной магнитно-резонансной спектроскопии тканевых экстрактах

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Простой и недорогой метод для определения холодную чувствительность и адаптация в мышах

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Обнаружение Axonally локализованного мРНК в срезах мозга с помощью высоким разрешением<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Сублимация DAN Матрицы для обнаружения и визуализации ганглиозидов в Rat ткани головного мозга для MALDI масс-спектрометрии изображений

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Высок объём анализ двигательного поведения в Assay остров дрозофилы

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Высокое разрешение 3D Изображение бешенства вирусной инфекции в Solvent-очищенных мозговой ткани

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Использование ближнего инфракрасного флуоресценции и высокого разрешения сканирования для измерения экспрессии белка в мозге грызунов

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...