Name: high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue at JoVE.com

Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Gyeong Chin, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, Steven E. Jacobsen s laboratuar, UCLA. Bu çalışma kısmen NIH 1R44GM095209-01 tarafından desteklenmiştir.

1. DNA Glucosylation ve Kontrol Reaksiyonları <ol><li> Buz üzerinde 1.5 mililitre reaksiyon tüpü, genomik DNA 5-10 mikrogram (son bir konsantrasyon için 30 mikrogram / mililitre), UDP-Glukoz 12.4 mikrolitre (80 mikromolar son bir konsantrasyon için), NEBuffer 4 31 mikrolitre karıştırmak nükleaz içermeyen su ile 310 mikrolitre toplam hacmi 310 mikrolitre getirmek. </li><li> 155 mikrolitre her iki tüp içine Split bu reaksiyon karışımı. </li><li> Sonra bir tüp 30 adet, T4-β-glukoziltransferaz veya 3 mikrolitre, ekleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırın. Ikinci tüp kontrol reaksiyon, bu nedenle T4 BGT yerine, 3 mikrolitre su ekleyin. </li><li> T4-BGT örnek bölgesindeki 5-hydroxymethylcytosine grupların hidroksil grubu şekeri ekleyin ve bu süre boyunca, her iki tüpte 12 ila 18 saat boyunca 37 derece santigrat inkübe edin. </li></ol> 2. Kısıtlama Enzim Sindirim <ol><li> Etiket üç 0.2 mililitre PCR-strip tüpleri numaraları 1&#39;den 3&#39;e kadar. Her birine reaksiyon karışımının kısım 50 ul. </li><li> Etiket üç 0.2 mililitre PCR-strip tüpleri numaraları ile 4 (6). Her kontrol karışımı kısım 50 ul. </li><li> MspI 100 birim, ya da 1 mikrolitrelik, 1 ve 4 tüpler içine ekleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırın. </li><li> HpaII 50 ünite, ya da 1 mikrolitrelik, 2 ve 5 tüpler içine ekleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırın. </li><li> Denetimleri gibi, 3 ve 6 tüpler bir şey eklemek değil. </li><li> 37 santigrat derece sıcaklıkta 6 tüpleri en az 4 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Her tüpe 1 mikrolitrelik Proteinaz K ekleyin ve 30 dakika boyunca 40 dereceye inkübe. </li><li> 10 dakika boyunca 95 santigrat derece az kuluçka Proteinaz K inaktive. </li></ol> 3. PCR / qPCR DNA analiz Bu protokol son nokta iyi bir performans gösterilmiştir PCR NEB LongAmp Taq kullanır. Diğer PCR protokolleri ikame edilebilir. <ol><li> 5X LongAmp Taq Reaksiyon Tamponu, 10 millimolar dNTP, 10 mikromolar İleri Primer 1 mikrolitrelik, 10 mikromolar Ters Primer 1 mikrolitrelik, 3 mikrolitre şablon 1.5 mikrolitre 10 mikrolitre: buz üzerinde 0.2 mililitre PCR reaksiyonu tüp için aşağıdaki bileşenleri ekleme önceki adımları LongAmp Taq DNA Polimeraz 1 mikrolitrelik, ve nükleaz içermeyen su 50 mikrolitre DNA. Bu birimler kullanılan PCR protokolü göre değişebilir. </li><li> Yavaşça reaksiyon karışımı. Gerekirse, hızlı bir dönüş tüpün dibine tüm sıvı toplamak. </li><li> Isıtmalı bir kapaksız bir PCR kullanarak, mineral yağ ile örnek Yerleşimi. </li><li> Celsius 94 derece önceden ısıtılmış blok buz bir PCR PCR tüpleri transferi ve bisiklet programını başlatmak. 3-adım PCR rutin bir, 30 saniye, 15 saniye boyunca 94 derece santigrat denatürasyon 30 döngüleri,, 30 saniye için tavlama santigrat 55 ila 65 derece ve 65 derece santigrat uzantısı takip için 94 santigrat derece bir ilk denatürasyon adım olmalıdır 20 saniye, ya da kb ortalama 50 saniye. Bu 5 dakika boyunca 65 santigrat derece bir final uzantısı tarafından takip edilmelidir. Real-time PCR de 5-methylcytosine ve 5-hydroxymethylcytosine miktarları ölçmek için yapılabilir. Lütfen özel bilgiler için neb.com bulunan ürün kılavuzu, bakınız. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 farklı fare Balb / C doku örnekleri lokus 12 5-hydroxymethylcytosine miktarların karşılaştırılması. (A), End-point PCR. (B) Gerçek zamanlı PCR. Dört fare dokulardan DNA analiz edildi. Karşılaştırmalı amaçlar için, gerçek zamanlı PCR veri kesilmemiş DNA normalize edildi. Standart eğri kopya sayısını belirlemek için kullanılmıştır. Örnekleri sindirilmemiş kontrol kopya sayısı (No 5), 1-6 örnekleri kopya sayısı bölerek normalize olabilir. Kutulu jel şeritli 5-HMC mevcut değişim gösterir.

<ol>
	<li>Sadri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li><li>Mathur, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene. 108, 1-6 (1991).</li><li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li></ol>

Ted ve Romanlar her ikisi de, bu makalenin yazarları, NEB çalışanları; Ted bu kit geliştirme nezaret Uygulamalar &amp; Geliştirme Bölümü Direktörü olan, Romanlar kiti ana geliştiricisi.

Bu deneyde kurarken pek çok kritik şeyler var. İlk olarak, genomik DNA glucosylation tamamlanması için devam eder önemlidir. T4 BGT dizisi özgüllüğü bilinen ve substrat dizisi için başka seçeneğimiz yok gibi görünüyor. Bu nedenle, bazı durumlarda, daha uzun inkübasyon sürelerinde gerekli olabilir. İkincisi, MspI ve HpaII sindirim arka plan sinyal önlemek için tam olmalıdır. Bu kısıtlama enzimler için, 4 saatlik bir inkübasyon süresi tavsiye, ama eksik bölünme görülmektedir uzun inkubasyon yapılabilir. Üçüncü, giriş DNA miktarı 20 NGS DNA son nokta PCR için kullanılan bu yana, yer olup olmamasına bağlı olarak ayarlanabilir. Son olarak, 5-mC ve 5-HMC kantifikasyon genomik DNA ile paralel olarak çalıştırmak olabilir sağlanan kontrol DNA kullanmanızı öneririz.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>EpiMark&trade; 5-hmC and 5-mC Analysis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>E3317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom per experiment; provided by user</td>
</tr>
<tr>
<td>LongAmp&reg; Taq DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0323</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N0447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>molecular biology grade water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection in balb/c brain tissue

DNA hydroxymethylation DNA bilinen uzun bir değişiklik, ancak son zamanlarda bir epigenetik araştırma odağı haline gelmiştir. Memeli DNA enzimatik CpG dinükleotidleri bağlamda ağırlıklı olarak, 5-mC sitozin (C) kalıntılarının 5. karbon pozisyonunda değiştirilmiş. 5-mC, geliştirme ve hastalık yer olduğuna inanılan enzimlerin Tet aile, 5-HMC enzimatik oksidasyon için uygun. Şu anda, 5-HMC biyolojik rolü tam olarak anlaşılmış değildir, fakat bir biyolojik belirteç olarak potansiyeli nedeniyle ilgi bir sürü oluşturuyor. Bu fare embriyonik kök (ES) ve nöronal hücrelerin 5-hydroxymethylcytosine tespit birçok çığır açan çalışmaları nedeniyle. Bisülfit sıralama yöntemleri de dahil olmak üzere, Araştırma Teknikleri, 5-mC ve 5-HMC kolayca ayırt etmek mümkün değildir. Birkaç protokoller sıvı kromatografisi kütle spektrometresi analizi veya genomik DNA sindirilmiş tek nükleosidlerin ince tabaka kromatografisi ile birleştiğinde de dahil olmak üzere, genom küresel miktarda 5-hydroxymethylcytosine ölçebilirsiniz var. Dot blot analizi, immünofloresan, ya da hydroxymethylated DNA yağış için kullanılabilir, ancak bu antikorlar tek baz resolution.In Ayrıca zorunda değilsiniz Antikorlar, hedef 5-hydroxymethylcytosine de var olduğunu, çözünürlük immunoprecipitated DNA ve büyüklüğüne göre değişir mikroarray deneyler, prob tasarımı bağlıdır. 5-hydroxymethylcytosine epigenetik düzenleme genom ya da rolünü tam olarak nerede var bilinmediğinden, bu yeni teknikler, lokus spesifik hydroxymethylation belirlemek için gereklidir. EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, bu iki özel lokusların değişiklikler arasında ayrım için bir çözüm sağlar. EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, 5-methylcytosine ve belirli bir DNA lokus içinde 5-hydroxymethylcytosine tanımlanması ve kantitatif için basit ve sağlam bir yöntem. Bu enzimatik yaklaşım, basit 3 adım protokol isoschizomers MspI ve HpaII diferansiyel metilasyon duyarlılığı kullanır. 5-hydroxymethylcytosine glukoz moeity ekleyerek, ilgi Genomik DNA T4 BGT ile tedavi edilir. Bu reaksiyon dizisi bağımsız, bu nedenle 5-HMC glucosylated olacak; değiştirilmemiş veya 5-mC içeren DNA etkilenmeyecektir. Bu glucosylation sonra kısıtlama endonükleaz sindirim tarafından takip edilmektedir. MspI ve HpaII aynı sıra (CCGG) farkındayız ama farklı metilasyon devletlere duyarlıdır. Sitozin blokları bölünme ya da herhangi bir değişiklik (5-mC, 5-HMC veya 5-ghmC): HpaII sadece bir sitenin tamamen değiştirilmemiş parçalayarak. MspI 5-mC ve 5-HMC, ama 5-ghmC tanır ve keser. Protokol üçüncü bölümü PCR ile odağı sorgulama. Giriş DNA az 20 ng kullanılabilir. Deneysel (glucosylated ve sindirilmiş) ve kontrol (alay glucosylated ve sindirilmiş) bir ilgi CCGG sitesi (100-200 bp) yan primerler ile hedef DNA amplifikasyonu yapılır. CpG sitesi 5-hydroxymethylcytosine içeriyorsa, bir grup glucosylation ve sindirim sonra tespit, ancak olmayan glucosylated bir tepki olarak değil. Gerçek zamanlı PCR hydroxymethylcytosine bu özel site ne kadar bir yaklaşım verecektir. Bu deneyde, bir fare Babl / C beyin örnek 5-hydroxymethylcytosine miktarı bitiş noktası PCR ile analiz eder.

Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue at JoVE.com

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, analiz etmek ve SPE larındaki lokus içinde 5-methylcytosine ve 5-hydroxymethylcytosine ölçmek için kullanılabilir. Kiti, 5-HMC hidroksil grubu β-glukoziltransferaz (T4-BGT) kullanan bir enzimatik reaksiyon ile glikoz eklenmesiyle 5-5-HMC mC ayırır. 5-HMC CCGG bağlamında oluştuğunda, bu değişikliği olmayan bir cleavable sitesine cleavable MspI sitesi dönüştürür.

Balb / C Beyin Dokusu Yüksek Hassasiyet 5-hydroxymethylcytosine Algılama

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Fareler Soğuk Hassasiyeti ve Uyum belirlenmesi için Basit ve ucuz Yöntem

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Yüksek üretilen iş analiz Locomotor davranış Drosophila Adası tahlil

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...