Name: live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish at JoVE.com

Wij danken de leden van de Rosenblatt laboratorium voor wetenschappelijke discussies, suggesties en opmerkingen. We willen ook graag aan Maria Halloran die vriendelijk op voorwaarde dat de plasmide coderend voor RFP-UtrCH en David Grunwald, die op voorwaarde dat de CK bedanken: GFP transgene zebravis. Dank ook aan Gretchen Koning en het personeel van de Centrale zebravis Resource aan de Universiteit van Utah voor een uitstekende onderhoud en de verzorging van de zebravis. Dit werk werd ondersteund door New Innovator Award NIH-NIGMS NIH directeur een DP2 OD002056-01 naar JR. GTE werd ondersteund door NIH Multidisciplinaire Cancer Training Program Grant 5T32 CA03247-8.

Basic Workflow voor de visualisatie van Actin Dynamics Tijdens Cel Extrusion in de epidermis van de ontwikkelingslanden zebravis De epidermis van de zich ontwikkelende zebravis bestaat uit twee verschillende lagen, de oppervlaktelaag (of periderm) en een basale laag van cellen die de basale membraan twee contact. De cellen van de buitenste oppervlaktelaag ondergaan apoptose en worden geëlimineerd uit het weefsel door extrusie 3 (Figuur 1). Om dit te visu...

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

Het protocol hier beschreven demonstreert een eenvoudige en doeltreffende methode om het proces van extrusie visualiseren in een live epitheelweefsel. Dit type van experiment laat ons toe om te onderzoeken subtiliteiten van actine dynamiek nog niet eerder op prijs gesteld in vaste weefsel analyses, en daarom een ​​aanvulling op gemeenschappelijke immunofluorescentie methoden. We kunnen dit protocol in combinatie met chemische remmers of genetische mutanten beter te analyseren het extrusieproces en studie ziektebeeld...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam </th><th> Type </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reagens </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reagens </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Crossing Tanks </td><td> Gereedschap </td><td> Thoren Aquatic Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De Pipet Pump </td><td> Gereedschap </td><td> Bel Art Producten </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ Pasteur Pipet </td><td> Gereedschap </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-injectie Mold </td><td> Gereedschap </td><td> Adaptieve Science Tools </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> 100x15mm Cultuur Plate </td><td> Gereedschap </td><td> Visser </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Bruin micropipet Puller </td><td> Gereedschap </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Model P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas capillairen met Filament </td><td> Gereedschap </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1,0 mm, ID 0.78mm, 10cm lengte </td></tr><tr><td> Electrode Opslag Jar </td><td> Gereedschap </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Phenol Red </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% in DPBS </td></tr><tr><td> Druk-Controlled Microinjector en micromanipulator </td><td> Gereedschap </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> 35x10mm Cultuur Dish </td><td> Gereedschap </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticine) </td><td> Reagens </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / ml in dH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Forceps </td><td> Gereedschap </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm Pin Holder </td><td> Gereedschap </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Plaats Pins </td><td> Gereedschap </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 26007-02 en-03 </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Cultuur Schaal met 1,5 dekglaasje </td><td> Gereedschap </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Low Melt Agarose </td><td> Reagens </td><td> Visser </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaïne </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Ontleden Microscoop </td><td> Microscoop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Ontleden Microscoop </td><td> Microscoop </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescerende dissectiemicroscoop </td><td> Microscoop </td><td> Olympus </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning Disc confocale microscoop </td><td> Microscoop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse Ti </td><td> Uitgerust met een Yokagawa draaiende schijf hoofd </td></tr><tr><td> CCD Camera </td><td> Camera </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micron vierkante pixels </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

Homeostatische onderhoud van epitheelweefsels vereist de voortdurende verwijderen van beschadigde cellen zonder verstoren barrièrefunctie. Onze studies hebben gevonden dat stervende cellen signalen sturen naar hun live buren om vormen en contract een ring van actine en myosine dat het uitgeworpen uit het epitheliale terwijl het vel sluiten eventuele lacunes die misschien hebben geresulteerd uit zijn afrit, een proces genoemd cel extrusie 1. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we één methode om induceren en imago extrusie in de larvale zebravis epidermis. Tot visualiseren extrusie, we injecteren een rode fluorescerend eiwit gelabelde probe voor F-actine in een-cellig stadium transgene zebravis embryo uitdrukken groen fluorescerend proteïne in de epidermis en induceren apoptose door toevoeging van G418 naar larven. Vervolgens gebruiken we time-lapse imaging op een spinning disc confocale microscoop te actine dynamiek en epitheelcellen gedragingen observeren tijdens het proces van apoptotische cel extrusie. Deze aanpak laat ons toe het extrusieproces onderzoeken in live epithelia en zal een laan om ziekte toestanden veroorzaakt door het onvermogen om apoptotische cellen elimineren bestuderen.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish at JoVE.com

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Stervende cellen zijn geëxtrudeerd uit epitheelweefsels door gezamenlijke contractie van naburige cellen zonder verstoring van de barrièrefunctie. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we methoden om te induceren en imago extrusie in het larvale zebravis epidermis op cellulair resolutie.

Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissectie van organen van de Adult zebravis

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

De Tomaat / GFP-FLP / FRT Methode voor Live Imaging van Mozaïek Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorcellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analyse van bèta-cel functie met behulp van de resolutie van de eencellige Calcium Imaging in Zebrafish eilandjes

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...