Name: live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00
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Wir danken Mitglieder der Rosenblatt Labor für wissenschaftliche Diskussionen, Anregungen und Kommentare. Wir möchten auch Mary Halloran, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt das Plasmid kodiert RFP-UtrCH und David Grunwald, der CK versorgt haben: GFP transgener Zebrafische. Danke auch an Gretchen König und die Mitarbeiter der Zentrale Zebrafisch Ressourcen an der Universität von Utah für exzellente Wartung und Pflege der Zebrafisch. Diese Arbeit wurde vom New Innovator NIH-NIGMS NIH Director des Award 1 DP2 OD002056-01 bis JR unterstützt. GTE wurde durch die NIH Multidisziplinäre Cancer Schulungsprogramm zu gewähren 5T32 CA03247-8 unterstützt.

Grundlegende Workflow für die Visualisierung von Aktindynamik während der Zellteilung Extrusion in der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch Die Epidermis der Entwicklung Zebrafisch besteht aus zwei verschiedenen Schichten, die Oberflächenschicht (oder Periderm) und einer basalen Schicht aus Zellen, die die Basalmembran 2 Kontakt besteht. Die Zellen der äußeren Oberflächenschicht Apoptose und werden aus dem Gewebe durch Extrusion 3 (Abbildung 1) ...

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	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

Die hier beschriebene Protokoll zeigt eine einfache und unkomplizierte Methode, um den Prozess der Extrusion in einer Live-Epithelgewebe zu visualisieren. Diese Art von Experiment ermöglicht es uns, Feinheiten der Aktin-Dynamik nicht zuvor in fixiertem Gewebe Analysen geschätzt zu untersuchen, und daher ergänzt gemeinsamen Immunfluoreszenz-Methoden. Wir können dieses Protokoll in Kombination mit chemischen Inhibitoren oder genetische Mutanten eine bessere Analyse der Extrusion und Studium Erkrankungen mit dem Scheit...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Catalog Number </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reagens </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reagens </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Crossing Tanks </td><td> Werkzeug </td><td> Thoren aquatischer Systeme </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Die Pipet Pump </td><td> Werkzeug </td><td> Bel Art Products </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ Pasteurpipette </td><td> Werkzeug </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroinjektion Mold </td><td> Werkzeug </td><td> Adaptive Science Tools </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> 100x15mm Kulturplatte </td><td> Werkzeug </td><td> Fischer </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown Mikropipette Puller </td><td> Werkzeug </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Modell P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren mit Filament </td><td> Werkzeug </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> B1400-78 bis 10 </td><td> OD 1,0 mm, ID 0.78mm, 10cm Länge </td></tr><tr><td> Aufbewahrung der Elektroden Jar </td><td> Werkzeug </td><td> World Precision Instruments </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Phenol Red </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% in DPBS </td></tr><tr><td> Pressure Controlled Mikroinjektor und Mikromanipulator </td><td> Werkzeug </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> 35x10mm Kulturschale </td><td> Werkzeug </td><td> CELLSTAR </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> Reagens </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / mL in dH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Pinzetten </td><td> Werkzeug </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm Pin-Halter </td><td> Werkzeug </td><td> Feine Science Tools </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Legen Pins </td><td> Werkzeug </td><td> Feine Science Tools </td><td> 26007-02 und-03 </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Kulturschale mit 1,5 Deckglas </td><td> Werkzeug </td><td> MatTek </td><td> P35G-1,5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Low Melt Agarose </td><td> Reagens </td><td> Fischer </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Präpariermikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Präpariermikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescent Präpariermikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning Disc Konfokalmikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse-Ti </td><td> Ausgestattet mit einem Yokagawa Spinning Disc-Kopf </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Kamera </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micron quadratischen Pixeln </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

Homöostatische Wartung von epithelialen Geweben erfordert die kontinuierliche Beseitigung von geschädigten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Unsere Studien haben herausgefunden, dass sterbende Zellen Signale zu senden, um ihre Nachbarn zu leben, um Form und Vertrag einen Ring aus Aktin und Myosin, dass es wirft aus der epithelialen Blatt beim Schließen etwaiger Lücken aus seiner Ausfahrt hätten ergeben können, bezeichnet ein Verfahren, Zell-Extrusion 1. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Induktion und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis. Zur Visualisierung Extrusion, injizieren wir ein rot fluoreszierendes Protein markierte Sonde für F-Aktin in einem-Zell-Stadium transgenen Zebrafisch-Embryos, die grün fluoreszierendes Protein in der Epidermis und induziert Apoptose durch Zugabe von G418 zu Larven. Wir verwenden dann Zeitraffer-Imaging auf eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop zu Aktindynamik und Epithelzellen Verhalten während des Prozesses der apoptotischen Extrusion beobachten. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die Extrusion in Live-Epithelien zu untersuchen und eine Allee zu Erkrankungen durch das Versäumnis, apoptotische Zellen zu eliminieren verursacht Studie liefern.

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Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...