Name: live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00
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Ringraziamo i membri del laboratorio Rosenblatt per discussioni scientifiche, suggerimenti e commenti. Vorremmo anche ringraziare Maria Halloran che ha gentilmente fornito la codifica plasmide RFP-UtrCH e David Grunwald che ha fornito il CK: GFP zebrafish transgenico. Grazie anche a Gretchen re e il personale della risorsa Zebrafish centralizzata presso l&#39;Università dello Utah per la manutenzione eccellente e la cura del pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto da Innovator Award di New NIH-NIGMS direttore del NIH di 1 DP2 OD002056-01 a JR. GTE è stato sostenuto dalla formazione multidisciplinare del cancro del NIH Grant Program 5T32 CA03247-8.

Flusso di lavoro di base per la visualizzazione di Dinamica actina durante l&#39;estrusione cella nel Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo L&#39;epidermide del pesce zebra di sviluppo è composto da due strati distinti, lo strato superficiale (o periderm) e uno strato basale di cellule che contattare la membrana basale 2. Le cellule dello strato superficiale esterno apoptosi e vengono eliminati dal tessuto di estrusione 3 (Figura 1). Per visualizzar...

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	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

Il protocollo qui descritto viene illustrato un metodo semplice e diretto per visualizzare il processo di estrusione in un tessuto vivo epiteliale. Questo tipo di esperimento ci permette di esaminare sottigliezze delle dinamiche di actina in precedenza non apprezzati nelle analisi del tessuto fisso, e quindi, integra comuni metodi di immunofluorescenza. Possiamo usare questo protocollo in associazione con inibitori chimici o mutanti genetici per analizzare meglio il processo di estrusione e stati patologici studio assoc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Tipo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reagente </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reagente </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Serbatoi Crossing </td><td> Strumento </td><td> Thoren Aquatic Sistemi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La pompa Pipettare </td><td> Strumento </td><td> Bel Art Prodotti </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ pipetta Pasteur </td><td> Strumento </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Microiniezione Mold </td><td> Strumento </td><td> Adaptive Scienza Tools </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura Piastra 100x15mm </td><td> Strumento </td><td> Pescatore </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipetta Puller </td><td> Strumento </td><td> Sutter strumento aziendale </td><td> Modello P97 </td><td></td></tr><tr><td> Capillari in vetro borosilicato con filamento </td><td> Strumento </td><td> Sutter strumento aziendale </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, ID 0,78 millimetri, lunghezza 10 centimetri </td></tr><tr><td> Conservazione elettrodi Jar </td><td> Strumento </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso fenolo </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% nel DPBS </td></tr><tr><td> Pressione controllata Microinjector e Micromanipolatore </td><td> Strumento </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura Dish 35x10mm </td><td> Strumento </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> Reagente </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / ml in DH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinze </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12 centimetri Pin Holder </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Inserisci Pins </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 26007-02 e-03 </td><td></td></tr><tr><td> Piatto di vetro Cultura basso con 1,5 coprioggetti </td><td> Strumento </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Low Melt agarosio </td><td> Reagente </td><td> Pescatore </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescente microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscopio confocale Disco </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> Ti Eclipse </td><td> Dotato di un disco che gira la testa Yokagawa </td></tr><tr><td> CCD </td><td> Macchina fotografica </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micron pixel quadrati </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

Mantenimento dell&#39;omeostasi dei tessuti epiteliali richiede la rimozione continua di cellule danneggiate senza interrompere la funzione di barriera. I nostri studi hanno trovato che le cellule morenti inviare segnali ai loro vicini di formare e vivere contratto un anello di actina e miosina che lo espelle fuori dal foglio epiteliali durante la chiusura eventuali lacune che potrebbero avere provocato dalla sua uscita, un processo chiamato estrusione in cella 1. L&#39;ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrive un metodo per indurre e estrusione immagine nell&#39;epidermide zebrafish larvale. Per visualizzare estrusione, abbiamo iniettare una sonda rossa proteina fluorescente etichettato per la F-actina in una cella di embrioni di zebrafish fase transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde a livello epidermico e indurre apoptosi mediante l&#39;aggiunta di G418 di larve. Utilizziamo quindi time-lapse imaging su un microscopio confocale a disco rotante per osservare dinamiche di actina e dei comportamenti delle cellule epiteliali durante il processo di estrusione cellulare per apoptosi. Questo approccio ci permette di indagare il processo di estrusione a vivere epiteli e fornirà una via per studiare stati di malattia causata dalla mancata eliminazione di cellule apoptotiche.

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Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L&#39;ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell&#39;epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

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Biologia

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