Name: live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00
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Agradecemos a membros do laboratório Rosenblatt para discussões científicas, sugestões e comentários. Gostaríamos também de agradecer a Mary Halloran, que gentilmente nos cedeu o plasmídeo RFP-UtrCH e David Grunwald que forneceu o CK: GFP transgênicos zebrafish. Obrigado também a Gretchen Rei e do pessoal da Resource Zebrafish centralizado na Universidade de Utah para excelente manutenção e cuidados com o peixe-zebra. Este trabalho foi financiado pelo NIH-Award NIGMS NIH Director do New Innovator uma DP2 OD002056-01 a JR. GTE foi apoiado pelo NIH Multidisciplinar de Câncer Programa de Treinamento Grant 5T32 CA03247-8.

Fluxo básico para a visualização de Actina Dynamics durante a extrusão celular na epiderme Zebrafish desenvolvimento A epiderme do peixe-zebra em desenvolvimento é composto de duas camadas distintas, a camada de superfície (ou periderme) e uma camada basal de células que o contato da membrana basal 2. As células da camada de superfície externa sofrem apoptose e são eliminados a partir do tecido por extrusão 3 (Figura 1). Para visualizar este pr...

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	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

O protocolo aqui descrito demonstra um método simples e direta para visualizar o processo de extrusão em um tecido vivo epiteliais. Este tipo de experimento nos permite examinar sutilezas de actina dinâmica antes não apreciada em análises de tecido fixado, e, portanto, complementa métodos comuns de imunofluorescência. Podemos usar este protocolo, em combinação com inibidores químicos ou mutantes genéticos para analisar melhor o processo de extrusão e estados de doença estudo associado à falha de remover e ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Tipo </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reagente </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reagente </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Tanques travessia </td><td> Ferramenta </td><td> Thoren Sistemas Aquáticos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A bomba de Pipetar </td><td> Ferramenta </td><td> Art Bel Produtos </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ Pipete Pasteur </td><td> Ferramenta </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Mold microinjeção </td><td> Ferramenta </td><td> Ferramentas Adaptive Ciência </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> Placa 100x15mm Cultura </td><td> Ferramenta </td><td> Pescador </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipeta Puller </td><td> Ferramenta </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Modelo P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidro com filamento </td><td> Ferramenta </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, ID 0,78 milímetros, comprimento 10 centímetros </td></tr><tr><td> Jar Armazenamento eletrodo </td><td> Ferramenta </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Vermelho de fenol </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% em DPBS </td></tr><tr><td> Pressão controlada microinjetor e micromanipulador </td><td> Ferramenta </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> Dish Cultura 35x10mm </td><td> Ferramenta </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> Reagente </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / mL em dH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinça </td><td> Ferramenta </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12 centímetros Titular Pin </td><td> Ferramenta </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Inserir Pinos </td><td> Ferramenta </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 26007-02 e-03 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro Dish Cultura inferior com 1,5 lamela </td><td> Ferramenta </td><td> Mattek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Low Melt Agarose </td><td> Reagente </td><td> Pescador </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaina </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação </td><td> Microscópio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação </td><td> Microscópio </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescentes microscópio de dissecação </td><td> Microscópio </td><td> Olimpo </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Confocal Spinning Disc </td><td> Microscópio </td><td> Nikon </td><td> Eclipse Ti </td><td> Equipado com uma cabeça girando disco Yokagawa </td></tr><tr><td> CCD Camera </td><td> Câmera </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micron pixels quadrados </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

Manutenção da homeostase dos tecidos epiteliais requer a remoção contínua de células danificadas, sem interromper a função de barreira. Nossos estudos descobriram que as células morrem enviar sinais para seus vizinhos ao vivo para formar e contratar um anel de actina e miosina que ejeta-lo para fora da folha epiteliais ao fechar eventuais lacunas que possam ter resultado de sua saída, um processo chamado de extrusão de células 1. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos um método para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval. Para visualizar extrusão, injetamos uma sonda de proteína vermelha fluorescente etiquetados para F-actina em uma única célula de embriões em estágio zebrafish transgênicos expressando a proteína verde fluorescente na epiderme e induzir a apoptose através da adição de G418 para as larvas. Em seguida, usamos lapso de tempo imagem em um microscópio confocal disco giratório de observar a dinâmica de actina e comportamentos de células epiteliais durante o processo de extrusão celular por apoptose. Essa abordagem nos permite investigar o processo de extrusão em viver epitélios e irá fornecer uma avenida para estudar estados de doença causada pela incapacidade de eliminar as células apoptóticas.

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Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Células que morrem são extrudados a partir de tecidos epiteliais pela contração concertada de células vizinhas, sem interromper a função de barreira. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos métodos para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval em resolução celular.

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; As células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...