Name: live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish at JoVE.com

Vi tackar medlemmar av Rosenblatt laboratoriet för vetenskapliga diskussioner, förslag och kommentarer. Vi vill också tacka Maria Halloran som välvilligt lämnat plasmiden kodning RFP-UtrCH och David Grunwald som tillhandahöll CK: GFP transgena zebrafisk. Tack också till Gretchen kung och personalen i den centraliserade Zebrafish Resurs vid University of Utah för utmärkt underhåll och skötsel av zebrafisk. Detta arbete stöddes av NIH-NIGMS NIH direktörens Nya Innovator Award 1 DP2 OD002056-01 till JR. GTE fick stöd av NIH Tvärvetenskaplig Cancer träningsprogram Grant 5T32 CA03247-8.

Grundläggande arbetsflöde för visualisering av Actin Dynamics Under Cell Extrudering i epidermis av utvecklingsländer Zebrafish Överhuden utvecklingsländernas zebrafisk består av två olika skikt, ytskiktet (eller periderm) och en basal lager av celler som kontaktar basalmembranet 2. Cellerna i det yttre ytskiktet genomgå apoptos och elimineras från vävnaden genom extrudering 3 (Figur 1). Att visualisera denna process i realtid, injicera vi RNA ...

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här visar på en enkel och okomplicerad metod för att visualisera processen av extrudering i en levande epitelvävnad. Denna typ av experiment tillåter oss att undersöka nyanser av aktin dynamik som inte tidigare uppskattat i fast vävnad analyser, och därför kompletterar gemensamma immunofluorescens metoder. Vi kan använda detta protokoll i kombination med kemisk-hämmare eller genetiska mutanter att bättre analysera extruderingsprocessen och studera stater sjukdom i samband med underl?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn </th><th> Typ </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reagens </td><td> Qiagen </td><td> 74.104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reagens </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Crossing Tankar </td><td> Verktyg </td><td> Thoren akvatiska system </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Den Pipettera Pump </td><td> Verktyg </td><td> Bel Art Products </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ Pasteurpipett </td><td> Verktyg </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroinjektion Mögel </td><td> Verktyg </td><td> Adaptiv Science Tools </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> 100x15mm odlingsplatta </td><td> Verktyg </td><td> Fisher </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brun mikropipett Puller </td><td> Verktyg </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Modell P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas kapillärer med glödlampor </td><td> Verktyg </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> B1400-78 till 10 </td><td> OD 1,0 mm, ID 0.78mm, 10cm längd </td></tr><tr><td> Elektrod Förvaringsburk </td><td> Verktyg </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Fenolrött </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% i DPBS </td></tr><tr><td> Tryckstyrda Microinjector och mikromanipulator </td><td> Verktyg </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> 35x10mm Kultur Dish </td><td> Verktyg </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> Reagens </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / ml i dH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Tång </td><td> Verktyg </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm Pin Hållare </td><td> Verktyg </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Sätt Pins </td><td> Verktyg </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.007-02 och-03 </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Kultur skålen med 1,5 coverglass </td><td> Verktyg </td><td> Mattek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Låg Smält agaros </td><td> Reagens </td><td> Fisher </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Analysera Mikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Analysera Mikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescerande Analysera Mikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning Disc konfokalmikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse Ti </td><td> Utrustad med en Yokagawa snurrande skiva huvudet </td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> Kamera </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micron fyrkantiga pixlar </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

Homeostatiska underhåll av epitelvävnader kräver kontinuerlig avlägsnande av skadade celler utan att störa barriärfunktion. Våra studier har visat att döende celler skickar signaler till sina bo grannar att bilda och kontrakt en ring av aktin och myosin som matas ut från epitelceller arket medan utgående eventuella luckor som kan ha resulterat från dess utgång, kallas en process cell extrudering 1. Den optiska klarhet utveckla zebrafisk ger ett utmärkt system för att visualisera extrudering i levande epitel. Här beskriver vi en metod att framkalla och bild extrudering i larval zebrafisk epidermis. Att visualisera extrudering, injicera vi en röd fluorescerande proteinet märkt probe för F-aktin i en-cells stadiet transgena zebrafisk embryon uttrycker grönt fluorescerande protein i epidermis och inducera apoptos genom tillsats av G418 till larver. Vi använder sedan tidsförlopp avbildning på en snurrande skiva konfokalmikroskop att observera aktin dynamik och epitelceller beteenden cell under arbetet med apoptotiska celler extrudering. Detta tillvägagångssätt tillåter oss att undersöka extruderingsprocessen i levande epitel och ger en aveny för att studera sjukdomar som orsakas av underlåtenhet att eliminera apoptotiska celler.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish at JoVE.com

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Döende celler extruderade från epiteliala vävnader genom samordnad kontraktion av angränsande celler utan att störa barriärfunktion. Den optiska klarhet utveckla zebrafisk ger ett utmärkt system för att visualisera extrudering i levande epitel. Här beskriver vi metoder för att framkalla och bild extrudering i larvernas zebrafisk överhuden på cellulär upplösning.

Bildproduktion för cell Extrudering från överhuden av utvecklingsländer Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live avbildning av Zebrafish embryonal hjärna av konfokalmikroskopi

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissektion av organ från vuxna Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Bildproduktion för cell motilitet och Actin cytoskelettet av enskilda nervceller och neurala celler Crest i Zebrafish embryon

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Två-foton-Based Fotoaktiveringen i Live Zebrafish embryon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Beredning av Utveckla och vuxna Drosophila Brains och retinae för Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Levande cell imaging av Early autophagy Evenemang: Omegasomes och Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Den Tomat / GFP-FLP / FRT Metod för Live avbildning av Mosaic vuxen<em&gt; Drosophila</em&gt; ljusmätare celler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analys av Beta-cell-funktion som använder Single-cell Resolution kalcium Imaging i zebrafiskar holmar

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...