Name: visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems
Uploaded: 2011-06-30T12:00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems at JoVE.com

<ol>
	<li>Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eccentric+exercise-induced+injury+to+rat+skeletal+muscle.">Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).</li><li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo+marker+of+myofibre+damage:+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability.">Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li><li>Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+secretory+membrane+with+FM1-43+fluorescence.">Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+repair+defects+in+muscular+dystrophy+are+linked+to+altered+interaction+between+MG53,+caveolin-3,+and+dysferlin.">Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin.</a> J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotection+of+ischemia/reperfusion+injury+by+cholesterol-dependent+MG53-mediated+membrane+repair.">Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair.</a> Circ Res. 107, 76-83 (2010).</li><li>Knab, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+of+exercise+behaviors+in+mice.">Repeatability of exercise behaviors in mice.</a> Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Massett, M. P., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+differences+in+responses+to+exercise+training+in+inbred+and+hybrid+mice.">Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).</li><li>Bansal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Беговая дорожка бег полезной методологии на обеспечение осуществления нагрузки у подопытных животных. Как методологии для измерения функции мышц или выносливость это общеизвестно шумных подход, который трудно выполнить в последовательно воспроизводимый модой 8. В общем, времени до изнеможения могут быть использованы в качестве конечной точки для решения основных различий между экспериментальными группами, например, между некоторыми нокаутом мышей линии и мышей дикого типа 9. Экспериментальные манипуляции, которые производят более тонкие различия, например, некоторые фармацевтические исследования, не может урегулировать разногласия выше шума, связанного с этой техникой. В целях обеспечения максимальной воспроизводимости и чувствительности этих методов важно для поддержания условий для сессии к сессии очень внимательно. Времени суток животных осуществляются, а также теплый период наблюдения условия использования являются важными факторами, и он должен оставаться последовательной от испытания к испытанию. Штамм эффекты могут оказать существенное влияние на дизайн беговой дорожке протоколы некоторых штаммов мышей может работать намного больше времени на беговой дорожке, чем другие штаммы и по-разному реагируют на выносливость 10. В качестве общей рекомендации, многие мыши будет иметь возможность запускать 200-300 метров в общем истощении исследования с постоянным увеличением скорости беговой дорожке (5 м / м с начальной скоростью 1 м / м добавили за каждую минуту после старта). За упражнения на выносливость мышей могут быть запущены в возрасте от 9 до 12 м / м в течение 30 минут два или три раза в неделю. Тем не менее, отдельные исследования, как правило, требуют некоторой оптимизации протокола в соответствии с индивидуальными потребностями экспериментальной. УФ-лазерного разрушения процедура показали, чтобы быть эффективным методом для измерения мощности мембраны ремонт скелетные мышечные волокна 3,6,11. Один жизненно важным компонентом для успеха этих экспериментов является использование только мышечные волокна, которые отображают прямые, стержень формы внешности с шаблоном регулярного страт и гладкой сарколеммой, что не появляется морщинистой. Если другие мышечные волокна выбираются мембраны ущерб может уже находиться в этих волокон и интерпретация результатов этих экспериментов могут быть сложными. Важно также, что ориентация волокон и определения области облучения быть как показано на рис 1. Это обеспечивает травмы воспроизводимых размера, что позволяет сравнение между волокнами. Если определена область травмы целиком лежит внутри волокна, внутренняя травма будет создан, а не нарушая сарколеммой. Кроме того, значение, рассчитанное для f / F 0 является очень чувствительной к интересующей нас области, отобранных для измерения средней флуоресценции. Площадь около 200 мкм 2, прилегающих к и в том числе места повреждения, является целесообразным. В отличие от области, определяемой за вред, эта область должна полностью лежать в пределах волокна. Если включить пространства вне волокна, в результате пустой области увеличится f / F 0 в волокнах с небольшим красителя запись при одновременном снижении f / F 0 в волокнах с более тяжелыми фенотипа. Это приводит к уменьшению чувствительности анализа, что делает сравнение между волокнами сложнее. Для анализа повреждений микропипетки, угол между микропипетки и блюдо со стеклянным дном должно быть примерно 45 градусов, с тем чтобы эффективно повреждение клеточной мембраны. Клетки были выбраны за ущерб, микропипетки должны быть плотно прикреплена к нижней части блюда и округлые клетки не должна использоваться так, скорее всего, они будут отделяться после микропипетки тыкать. Эксперименты Saponin permeabilzation менее технически сложных и сравнительно быстрого выполнения по сравнению с микропипетки проникновения анализов. Однако Есть несколько ограничений сапонин повреждения, в том числе, что только одна ячейка может быть использована на чашку с сапонин будет диффундировать и повредить другие клетки в этом блюде.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> Грызун беговой дорожке </td><td> Колумб инструменты Exer 3 / 6 или эквивалент </td><td></td></tr><tr><td> 70% этанола </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Препарирование инструментов, включая штраф щипцы наконечником, пружина ножниц </td><td> Инструменты Всемирного Precision </td><td></td></tr><tr><td> 2 мг / мл коллагеназы типа I. </td><td> Сигма </td><td></td></tr><tr><td> 0 Са 2 + Tyrode буфера (140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 2 мМ MgCl 2, рН 7,2, 290 мосм) </td><td> Сигма </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 мм Са 2 + Tyrode буфера (140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl 2, 5 мМ KCl, 10 HEPES мм, 2 мм MgCl 2, рН 7,2, 290 мосм) </td><td> Сигма </td><td></td></tr><tr><td> Температура управляемый орбитальный шейкер </td><td> Нью-Брансуик или эквивалент </td><td></td></tr><tr><td> Delta TPG Блюдо </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM 510 конфокальной микроскопии с предприятия 80 мВт лазерного УФ-или эквивалентные конфокальной микроскопии </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43 или FM4-64 красители </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Боросиликатное Капилляры Размер 0.8-1.0 х 100 мм </td><td> PYREX </td><td> Деталь № 9530-2 </td></tr><tr><td> Микропипетки съемник </td><td> Саттер инструменты </td><td> Модель P-97 </td></tr><tr><td> 3 оси микроманипулятора </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Сияние 2100 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии или эквивалент микроскопом </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Сигма </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems

Ремонт острого повреждения клеточной мембраны является элементарный процесс нормальной клеточной физиологии и дефектных мембраны ремонт был связан со многими дегенеративных заболеваний человека. Недавнее открытие MG53, как одного из ключевых компонентов машины запечатывания мембраны позволяет лучше молекулярного понимания фундаментальной биологии восстановления тканей, а также для потенциальных поступательного применения в регенеративной медицине. Здесь мы подробно экспериментальных протоколов для исследования в естественных функций MG53 по ремонту повреждения мышц использованием беговой дорожке протоколов упражнений на мышах, для тестирования бывших естественных мембран ремонт мощностей путем измерения красителя вступления в изолированных мышечных волокон, а также для мониторинга динамического процесса из MG53-опосредованной торговли пузырьков и ремонта клеточных мембран в культуре клеток с использованием живой клетки конфокальной микроскопии.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems at JoVE.com

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Описанные здесь протоколов, используемых для визуализации динамичный процесс MG53-опосредованной клеточной мембраны ремонт в целых животных и на клеточном уровне. Эти методы могут быть применены для исследования клеточной биологии плазмы опечатывания мембраны и регенеративной медицины.

Визуализация MG53-опосредованной клеточной мембраны Ремонт Использование В естественных условиях И В пробирке Системы

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Использование Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) для разработки средств диагностики

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Видео биоинформатики Анализ человеческих эмбриональных роста клеток колонии стволовых

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Белки мембранные наложения Пробирной: протокол для тестирования Взаимодействие растворимых и нерастворимых белков В пробирке</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Изображений Клеточная мембрана Травмы и субклеточных процессов, связанных с Ремонт

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Анализ РНК обработки реакций с помощью мобильного Бесплатные системы: 3 &#39;Конец расщепление пре-мРНК подложках<em&gt; В пробирке</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Измерение Жесткость<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Аорте при помощи мыши атомно-силовой микроскопии

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Потянув нанотрубок мембраны из гигантских однослойных везикул

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro и In Vivo подходы для определения проницаемости кишечной эпителиальных клеток

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...