Name: a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

الدكاترة. هي محل تقدير ويليامسون CJP Grimmelikhuijzen مايكل من جامعة كوبنهاغن (الدنمارك) لتوفير aequorin البلازميد. ومن المسلم به متعاون لدينا ، والدكتور رونالد J. نحمان من ARS - USDA (تكساس ، الولايات المتحدة) ، لتخليق الببتيد وتقديم للقارئ لوحة NOVOstar.

<ol>
	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs.">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biostable+agonists+that+match+and/or+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs.">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond,+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus.">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+and+non-selective,+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+and+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li><li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

كنا قادرين على تنفيذ التوصيف الوظيفي لمستقبلات neuropeptide first اكتشف من العناكب (القراد والعث والعناكب) ، ومستقبلات كاينين ​​القراد ، وذلك باستخدام هذا البروتوكول. هذا الأسلوب ثلاثة طلبات الابتدائي. أولا ، يمكن تطبيق هذه التقنية للمستقبل من خلال قياسات deorphanization النشاط يجند. ثانيا ، يمكن للمقايسة حل يجند مستقبلات العلاقات بين الهيكل والنشاط (ريال سعودي). ثالثا ، يمكن استخدام الأساليب في اكتشاف الأدوية. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة نشاط منبهات أو الخصوم على GPCR أي تقريبا. بدأنا على التكيف مع هذا البروتوكول للفحص من المكتبات الصغيرة. خط خلية تستخدم نحن لا يعبر عن بروتين موجود في كل مكان G G 16. لم نكن بحاجة لأن المفصليات مستقبلات كاينين ​​إشارة من خلال بروتين (جي كيو) وتتالي الكالسيوم داخل الخلايا والحفاظ على هذه الخصائص التي يشير في خلايا الثدييات كما هو موضح هنا.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO - K1 الخلايا </td><td> ATCC </td><td> CCL - 61 </td><td> ماناساس ، فرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. </td></tr><tr><td> F12K المتوسطة </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> التربسين - EDTA (10X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> مضاد فطري للمضادات الحيوية </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> OPTI - MEM انخفاض أنا متوسطة المصل </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin الكاشف </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663 - 03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep تدور عدة miniprep </td><td> شركة Qiagen </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE كاشف ترنسفكأيشن 6 </td><td> روش </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - جيدا بيضاء رقيقة أسفل لوحة microtitere </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> الكالسيوم الخالية من وسائل الاعلام DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C - 2944 </td><td></td></tr><tr><td> مشرق الخط عدادة الكريات </td><td> Hausser العلمية </td><td></td><td> هورشام ، والسلطة الفلسطينية </td></tr><tr><td> NOVOstar </td><td> Labtechnologies BMG </td><td></td><td></td></tr><tr><td> المنشور البرمجيات 4.0 </td><td> GraphPad شركة برمجيات </td><td></td><td> سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. </td></tr><tr><td> T - 25 و T - 75 قوارير </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 353014 و353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

مستقبلات هرمون المفصلية هي الاهداف المحتملة لمبيدات الآفات الرواية كما أنها تنظم العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية والسلوكية. الغالبية منهم ينتمون إلى الفصيلة من مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs). فقد ركزنا على المستقبلات التي تميز كاينين ​​المفصلية من القراد والبعوض. kinins المفصلية هي نيوروببتيد متعددة الوظائف مع myotropic ، مدر للبول ، ووظيفة الناقلات العصبية. هنا ، وهي طريقة لتحليل منهجي لهيكل والنشاط علاقات kinins الحشرات على كاينين ​​غيروي two مستقبلات معربا عن النظم الموصوفة. ونحن نقدم معلومات مهمة ذات الصلة لوضع النظير كاينين ​​biostable مع احتمال تعطيل مدر للبول ، myotropic ، و / أو عمليات الهضم في القراد والبعوض. وأعرب عن ستابلي المستقبلات كاينين ​​من قراد الأبقار جنوب العلس المتثني (Canestrini) ، وبعوض الزاعجة البعوض (لينيوس) ، في خط خلايا الثدييات CHO - K1. تم الانتهاء من التحليلات الفنية لهذه المستقبلات تلألؤ بيولوجي باستخدام لوحة فحص الكالسيوم الذي يقيس تلألؤ بيولوجي داخل الخلايا لتحديد مستويات الكالسيوم وبناء على طلب السيتوبلازمية الببتيد لهذه الخلايا المترابطة. هذا الأسلوب يستفيد من البروتين aequorin ، وهي معزولة عن photoprotein القناديل الانارة. نحن transfected عابر للaequorin البلازميد (mtAEQ/pcDNA1) في خطوط الخلايا التي عبرت عن ستابلي المستقبلات كاينين. ثم عولجت هذه الخلايا مع coelenterazine العامل المساعد ، والتي المجمعات مع aequorin داخل الخلايا. هذه السندات فواصل في وجود الكالسيوم ، التي تنبعث منها مستويات التلألؤ يدل على تركيز الكالسيوم. كما مستقبلات كاينين ​​إشارات من خلال إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا ، وترتبط شدة إشارة إلى قوة من الببتيد. هذا البروتوكول هو تجميع لعدة بروتوكولات مع التعديلات التي سبق وصفها ، بل يقدم خطوة بخطوة تعليمات للتعبير مستقرة GPCRs في خط خلايا الثدييات من خلال فحوصات لوحة فنية (Staubly وآخرون ، 2002 واسطبلات وآخرون ، 1997. ). باستخدام هذه المنهجية ، كنا قادرين على وضع خطوط الخلية مستقرة معربا عن البعوض والقراد المستقبلات كاينين ​​، قارن وقوة kinins البعوض الثلاثة ، تحديد المواقف الحرجة من الأحماض الأمينية للتفاعل يجند مستقبلات ، وأداء شبه سرعة فحص الببتيد المكتبة. لأن الحشرات kinins عرضة للتدهور السريع الأنزيمية التي peptidases الذاتية ، فهي محدودة في استخدامها كأدوات لمكافحة الآفات أو دراسات الغدد الصماء. ولذلك ، فإننا أيضا اختبار النظير كاينين ​​تحتوي على الحمض الأميني isobutyric (AIB) لتعزيز قوتها وbiostability. هذا التناظرية ببتيداز المقاوم يمثل تؤدي مهمة في تطوير biostable النظير الحشرات وكاينين ​​قد تساعد في تطوير neuropeptide القائم على استراتيجيات مكافحة المفصليات.

Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

هذا البروتوكول يوفر إرشادات لاختيار الخط نسيلي الخلية ومقايسة تلألؤ بيولوجي الكالسيوم لتحليل العلاقات بين الهيكل والنشاط من نيوروببتيد المفصلية توليفها على GPCRs المشابهة لها. ويمكن استخدام هذا الاختبار لمستقبلات deorphanization والدراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط التمثيلي للتصميم الصناعي والببتيد / المخدرات يؤدي الاكتشاف.

والفحص ضوء بارد الكالسيوم عن التحليل الوظيفي من البعوض ( الزاعجة المصرية) والقراد ( مروحية الرأس المتثني) G - يقترن بروتين المستقبلات

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

بروتوكول لجمع ويلطخ Hemocytes من الحمى الصفراء البعوض الزاعجة المصرية</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

اللعاب، الغدد اللعابية، وجمع اللمف الدموي من القراد اللبود الكتفي

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

التلاعب الجيني في<em&gt; Δku80</em&gt; سلالات لتحليل الجينوم الوظيفي لل<em&gt; التوكسوبلازما جوندياي</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

تربية<em&gt; اللبود الكتفي،</em&gt; القراد الأسود أرجل: تغذية مراحل غير ناضجة على الفئران

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

حبة على أساس مقايسة متعدد لتحليل الملامح سيتوكين المسيل للدموع

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

والرزن التصاق الديناميكي للتحليل الوظيفي من العلاجات المضادة الالتصاق في مرض التهاب الأمعاء

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

الإنزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن لدراسة التفاعلات الوظيفية بين المستقبلات والأنزيمات

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

مصل الدم البشري المضادة-أقوابورين-4 غلوبيولين مناعي G الكشف بتحليل يستند إلى الخلية

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

الكشف عن مجموعه Hemolymph والتلقيح من المسام البدائية ميتارهيميوم في القراد Microplus Rhipicppus نحو دراسات علم الامراض لافقاريات

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...