Name: a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

Drs. CJP Grimmelikhuijzen en Michael Williamson van de Universiteit van Kopenhagen (Denemarken) worden gewaardeerd om het verstrekken van de aequorine plasmide. Onze medewerker, dr. Ronald J. Nachman van ARS-USDA (TX, USA), is erkend voor peptide synthese en voor het verstrekken van de Novostar plaat lezer.

1. Oprichting van stabiele cellijnen <ol><li> Kloon uw GPCR van rente en plaats deze in een expressievector voorzien van een 5 &#39;Kozak consensus sequentie (GCCA / GCCATGG) rond het startcodon voor een optimale ribosomale binding in een zoogdier systeem (Kozak, 1986). Hier gebruiken we het plasmide pcDNA3.1/Bm-KR voor de teek kinine-receptor, en het plasmide pcDNA3.1/Aedae-KR voor de mug kinine receptor (Holmes et al., 2003;. Pietrantonio et al., 2005.). De pcDNA3.1 (-) vector ampicillineresistentie codeert voor selectie in bacteriën en neomycine (G418) weerstand voor selectie in zoogdiercellen. </li><li> Grow CHO-K1 lege cellen (zonder plasmiden) (ATCC, Manassas, VA, Verenigde Staten) of andere gewenste cel lijn in een T-25 kolf (BD Falcon) bij 37 ° C in een 5% CO 2 bevochtigde incubator (Holmes et al. ., 2003). Alle verdere incubaties moet worden gedaan onder deze voorwaarden, tenzij anders aangegeven. Handhaaf de lege cellen in groei medium (F12K medium met 10% foetaal runderserum) met 1X antibiotica Antimycoticum (Invitrogen, CA). </li><li> Op te splitsen cellen, warm-up van alle oplossingen tot 37 ° C. Verwijder oude medium in de T-25 kolf en spoel na met 5 ml PBS en verwijder PBS. Om trypsinize cellen, voeg 2 ml PBS-trypsine-EDTA (34 ml PBS, 2 ml 7,5% natriumbicarbonaat, 4 ml 10x trypsine-EDTA) voor 2 minuten. Voeg 3 ml medium en aspireren medium op en neer om cellen te mengen. Transfer medium met cellen in een conische buis en centrifugeer gedurende 2 minuten bij ~ 200-300 g (1.000 rpm). Gooi supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml medium. Verdun de geresuspendeerde cellen tot een concentratie van 1:5 of 1:10 met vers medium en overdragen 5 ml in een nieuwe T-25 kolf. </li><li> Nadat de cellen gezond groeien (ongeveer 2-3 dagen), het zaad van de CHO-K1 cellen in T-25 weefselkweekflessen en groeien ze &#39;s nachts in de groei medium zonder antibiotica tot zij ongeveer 30% confluent (ongeveer 18 uur). De mate van confluentie kan worden vastgesteld door het observeren van cellen onder omgekeerde fluorescentie microscopie. </li><li> Bereid de volgende mengsels voor elk monster: <ol><li> Combineer 1-2 pg DNA (bijvoorbeeld: gebruik 4μl van 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) met 100 ul Opti-MEM ik Verminderde Serum Medium (Invitrogen). </li><li> Mix 6 pl Lipofectin Reagent (InvitrogenTM) in 100 ul F12K serum-vrij medium, het maken van een 1:1 verhouding van Lipofectin aan DNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-45 minuten. </li></ol> Meng de oplossingen van 1.5.1 met 1.5.2 in een druppelsgewijs fashion (totaal volume = 200 pi). Laten staan ​​bij kamertemperatuur 10-15 minuten. </li><li> Verwijder de oude groei medium van de cellen en was de cellen met 5 ml F12K serum vrij medium en verwijder vervolgens de F12K serum vrij medium. In een 15 ml tube, meng de transfectie mengsel in 1,8 ml vers F12K medium in een drop-wijs mode. Dan waste de cellen van stap 1.5 met PBS en voeg deze nieuwe transfectie oplossing voor de cellen. Incubeer gedurende 18 uur. </li><li> Verander het medium tot medium plus 10% foetaal runderserum F12K zonder antibiotica en &#39;s nachts incuberen. Splitsen de cellen in twee T-25 flessen met F12K medium plus 10% foetaal runderserum zonder antibiotica voor een ander 18 uur (voor het splitsen van cellen zie stap 1.3). </li><li> Vervang het medium met selectieve medium (F12K medium plus 10% foetaal runderserum met 800μg/ml Geneticine, Invitrogen). Cultuur van de cellen met behulp van de selectief medium voor 3-4 weken. Na verloop van tijd zal dit selecteren voor cellen die stabiel zijn opgenomen het plasmide in hun genoom DNA. Doorgaan met het onderhouden van de cellen met behulp van het onderhoud medium (F12K medium plus 10% foetaal runderserum met 400μg/ml Geneticine). Periodiek bevriezen cellijnen met 1:1 verhouding van bevriezing media (selectief medium met 20% DMSO) om verliest in geval van onvoorziene besmetting te voorkomen. </li><li> Het selecteren van klonale cellijnen: als een eerste stap, trypsinize en centrifugeer de cellen van stap 1.8 met het onderhoud medium zoals in stap 1.3. Re-schorten cellen in 5 ml onderhoud medium, neem dan 0,5 ml van de cel te schorten en voeg 4,5 ml vers onderhoud medium om een ​​10x verdunning te maken. Breng de 10x verdunning in 12 wells van een 96 wells-plaat, het toevoegen van 100 pi aan elk goed om te selecteren op individuele cellen. </li><li> Blijf 10x seriële verdunningen van deze cellen te maken voor een theoretische laatste schorsing van een cel per 100 pl (normaal gesproken de laatste verwatering zal in de orde van 10 -11 zijn om 10 -19, het totale aantal van 10x seriële verdunningen is ~ 19) . Onmiddellijk na elke verdunning, overdracht 100 ul van de verdunning in 12 putjes van de 96 wells plaat. Na 18 uur incubatie, in acht platen met 96 putjes onder een omgekeerde licht of fluorescentie microscoop en mark putten die lijken te bevatten slechts een enkele cel of twee cellen die duidelijk gescheiden van een enkele cel bevatten. Houd het observeren van elke dag en veranderen medium om de drie dagen. </li><li> Als de putten 80% confluENT (ongeveer een week), spoel gemarkeerd putten met 200 ul PBS en trypsinize ze met 100 ul PBS-trypsine-EDTA-oplossing. Transfer cellen van elk gemarkeerd goed in een putje van een 6-well plaat met 1 ml onderhoud medium. Groeien die cellen gedurende 3 dagen dan overdracht cellen in individuele T25 fles. Test deze cellen met behulp van de calcium-bioluminescentie test met agonist peptiden (zie hoofdstuk 2). </li><li> Selecteer een cellijn van stap 1.11 met de hoogste respons in het calcium-bioluminescentie plaat assay en uit te voeren voor de tweede keer de single celselectie volgende stappen 1.9-1.11. Periodiek bevriezen cellijnen. </li><li> Vanaf de tweede selectie beschreven in stap 1,12, kies dan 2-3 cellijnen met de hoogste respons in het calcium-bioluminescentie plaat assay en te onderhouden in de cultuur voor meer calcium bioluminescentie plaat assays. Blijf op de hoogte van de passage nummers. Van tijd tot tijd, bevriezen cellijnen van de vroege passages, zodat u kunt altijd terug naar hen als de cellijnen met meer passages stop het consequent uitvoeren. </li></ol> 2. De calcium bioluminescentie plaat-test <ol><li> Afbinden van de reporter gen van interesse in een expressievector. Hier gebruikten we aequorine plasmide mtAEQ/pcDNA1 (een geschenk van Drs. CJP Grimmelikhuijzen en Michael Williamson, Universiteit van Kopenhagen, Denemarken). Transformeren het plasmide in E. coli-cellen MC1061/PS (Invitrogen) en zuiveren ze met behulp van een spin-QIAprep Miniprep kit (Qiagen Inc.) In de laatste stap elueren het plasmide met Tris-buffer, zonder EDTA, geen water. </li><li> Grow cellijnen uit stap 1,13 uiting van de gewenste receptor in onderhoud medium. Wanneer de cellen zijn 90% confluent, trypsinize, centrifuge en vervolgens de cellen weer te schorten in 5 ml onderhoud medium zoals in stap 1.3. Verdunnen cellen (ongeveer 10x met het onderhoud medium) en tel het aantal cellen met cel teller (Bright-Line hemacytometer) onder microscopie. Stel het aantal cellen tot ongeveer 2 x 10 5 cellen / ml (gemiddeld 20 cellen in een van de negen vierkanten toonde in de hemacytometer). Seed 2 ml verdund cellen in de media in elk putje van een zes goed plaat. Incubeer 24 uur (de cellen moet ongeveer 60% confluentie bereikt na incubatie). </li><li> Verandering media in de 6 putten plaat OPTI-MEM medium. Voor elke goed, mix 96 ul OPTI-MEM met 4 ul Fugene 6 Transfectie reagens (Roche Biochemicals) in een microfugebuis en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 1 ug van aequorine / pcDNA een plasmide DNA in elke buis en dan zachtjes het monster schudden gedurende 1 minuut, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten. Voeg elk mengsel in elk putje in een druppelsgewijze manier, terwijl zachtjes schudden van de wells plaat. Incubeer de platen gedurende 6 uur en verander het medium tot medium dat 10% foetaal runderserum zonder antibioticum F12K. </li><li> Na het incuberen van de cellen in zes goed plaat gedurende 24 uur, trypsinize, centrifuge en resuspendeer de cellen als in stap 1.3. Tel het aantal cellen tot 400.000 cellen / ml als stap 2.1 en overdracht 100 pi (totaal 40.000 cells/100 pi) in elk putje van een 96-wells witte dunne bodem microtiterplaat (Costar 3610). Incubeer nog eens 24 uur tot ongeveer 80% confluentie cel. Dit is de optimale concentratie van cellen voor de bioluminescentie test. </li><li> Bereid 90μl/well van een calcium-vrij DMEM medium (Invitrogen) met 5 uM coelenterazine (Invitrogen) in het donker (coelenterazine is gevoelig voor licht). Neem de plaat uit 2,4, verwijder de oude media en voeg deze 90μl in elk putje. Incubeer de platen gedurende 3 uur in het donker bij 37 ° C en 5% CO 2, waarna de cellen in de plaat staan ​​klaar om getest te worden. </li></ol> 3. Apparaat in werking en data-analyse <ol><li> Elke bioluminescentie plaat lezer is anders. Wij voeren onze test met behulp van een Novostar (BMG Labtechnologies) plaat-lezer in bioluminensence mode. Als u een ander instrument, moet u aan te passen het protocol. </li><li> Spoel de plaat lezer pompen (of PRIME pompen) voor gebruik. Schakel het licht in de kamer voordat de plaat op de plaat houder. Zodra de plaat houder heeft gesloten, zet het licht aan. </li><li> Oplosbaar te peptiden (in een 1,5 ml Eppendorf buis) in de calcium-vrij DMEM media. Stel de &quot;Zuig Depth&quot; en &quot;Positie bepalen&quot; van de peptide-oplossing voor gebruik. Daag de cellen met 10 pi (10x) van verschillende concentraties van de peptiden (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, of andere gewenste peptide) en onmiddellijk beginnen met het opnemen van de lichtemissie. Wij hebben het instrument om de lichtemissie (465 nm) record voor elk putje om de 2 seconden voor een totale tijd van 50 seconden. </li><li> Zorg ervoor dat u een positieve controle, zoals een actieve analoge (analoge FFFSWGa is gebruikt, Taneja-Bageshwar et al.., 2009) en een negatieve controle, zoals vector alleen getransfecteerde cellen bevatten. De negatieve controle nodig zal zijn tijdens de data-analyse aan de basislijn drempel (zie de vertegenwoordiger van resultaten).Een onafhankelijke, niet-actieve peptide kan ook worden toegevoegd als een negatieve controle. </li><li> Na de run is voltooid, was het instrument pomp (of PRIME POMPEN), dan plaats je volgende peptide monster. Uw gegevens opslaan en opnieuw was de pompen. </li><li> Data handling: Breng de gegevens van de lichtemissie uit elk putje in een Microsoft Excel-gegevens sheet. </li><li> Plak de gegevens uit Excel naar Prism software 4.0 vanaf GraphPad Software Inc (San Diego, CA, USA). De verschillende peptide concentraties is de X-as en bioluminescentie-eenheden is de Y-as. Te normaliseren van de gegevens, plot een log-response curve. Selecteer een niet-lineaire regressie-curve fit analyse (sigmoïdale dosis-respons vergelijking met variabele helling) naar de concentratie-respons curves te verkrijgen voor elk peptide. Het programma plots de waarden in het einde en geeft de EG-50. </li><li> Elk experiment moet drie keer worden herhaald voor data-analyse. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Uitgedrukt in CHO-K1-cellen, de mug Aedes aegypti kinine-receptor gedroeg zich als een multiligand receptor en functioneel gereageerd op de concentraties zo laag als 1 nM van de drie endogenours Aedes kinins, Aedae kinins 1-3, getest afzonderlijk met behulp van de calcium-bioluminescentie plaat-test . Figuur 1 laat zien dat de rangorde van de potentie verkregen was Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, gebaseerd op de respectieve EC 50-waarden van Aedae-K-3, 16.04 nM; Aedae-K- 2, 26,6 nM en Aedae-K-1, 48.85 nM, die statistisch significant verschillend (P &lt;0.05) (Pietrantonio et al., 2005).. We hebben ook gebruik gemaakt van deze test om te bepalen welke kinine resten zijn van cruciaal belang voor de kinine peptide-receptor interactie. Insect kinine peptiden hebben een C-terminale pentapeptide dat de minimale sequentie die nodig zijn voor biologische activiteit, ook wel bekend als kern vertegenwoordigt. In tabel 1 zijn de kinine-peptide kern-analogen gesynthetiseerd als een Alanine vervanging serie van de kern van kinine pentapeptide FFSWGa en getest door een calcium-bioluminescentie plaat assay (Taneja-Bageshwar et al., 2006).. We vonden dat de aminozuren Phe 1 en Trp 4 waren essentieel voor de activiteit van het insect kinins voor beide receptoren. De test kan ook worden gebruikt om peptiden is ontworpen voor een verbeterde biostability test. Tabel 2 toont de ontworpen kinine analogen met amino isoboterzuur (AIB) getest op het vinkje recombinante kinine-receptor en Figuur 2 toont de activiteit vergelijking van zes alpha-amino isoboterzuur-analogen op de teek kinine receptor uitdrukken CHO-K1-cellijn door een calcium- bioluminescentie plate assay (Taneja-Bageshwar et al.., 2009). De hexapeptide analoge FFFSWGa is toegevoegd voor een positieve controle voor receptor-activiteit. De analoge FF [Aib] WGA resulteerde actiever dan dit hexapeptide controle analoog. De analoge met twee aminoisobutyric zuur vervangers, [Aib] FF [Aib] WGA, was de meest krachtige van de dubbele vervanging analogen getest (tabel 2 en figuur 2). Voor meer voorbeelden van hoe deze test is en kan worden aangebracht, zie Nachman en Pietantonio (2010), Nachman et al.. (2009), Taneja-Bageshwar et al.. (2008a), en Taneja-Bageshwar et al.. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Schatting van Aedes kinins effectieve concentratie (EC 50) op CHO-K1 E10 cellen door een calcium-bioluminescentie plate assay. De y-as in de concentratie-respons curves werd verkregen van bioluminescentie eenheden uitgedrukt als een percentage van de maximale respons waargenomen voor elk peptide. Datapunten geven het gemiddelde van zes identieke monsters verkregen gedurende drie onafhankelijke experimenten. Staven geven de standaardfout. (A) Schatting van Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Schatting van Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Schatting van Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 &lt;EC 50 Aedae-K2 &lt;EC 50 Aedae-K1, P &lt;0,05. Statistische analyse en grafieken waren met de GraphPad Prism 4.0 software. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Activiteit vergelijking van de zes alpha-amino isoboterzuur-analogen op de teek kinine receptor uitdrukken CHO-K1-cellijn door een calcium-bioluminescentie plaat-test. De y-as geeft procent maximale bioluminescentie eenheden voor elk analoge uitgedrukt als een percentage van de bioluminescentie waargenomen bij een concentratie ten opzichte van de maximale respons waargenomen bij alle concentraties getest voor elk analoog. Statistische analyse en grafieken werden uitgevoerd met GraphPad Prism 4.0 software. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Tick-receptor cellijn </td><td colspan="2"> Mosquito receptor cellijn </td></tr&gt; <tr><td> Peptiden </td><td> EC 50 (nM) </td><td > Maximale bioluminescentie respons bij een mM </td><td> EC 50 (nM) </td><td> Maximale bioluminescentie respons bij 1 mM </td></tr><tr><td> AFSWGa </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12.800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10.600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10.800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13.000 </td><td> 562 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12.700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Geschatte potenties (EG 50) en de maximale bioluminescentie reactie van alle peptiden getest op de pof en de mug-receptor getransfecteerde cellijnen *. * De EG 50 schat de concentratie die nodig is om een half-maximale respons te induceren. I: Inactieve als bioluminescentie reactie is minder dan 300 eenheden (niveau van de vector-only getransfecteerde cellen). A: De positie waar de respectievelijke residu in het peptide FFSWGa is vervangen door alanine. ND: De analoge werd getest, maar was of niet erg actief of niet actief was op lagere molarities, waardoor een EC50 kon niet worden vastgesteld. <table border="1"><tbody><tr><td> K-AIB-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-2 </td><td> [Α MEF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-6 </td><td> [AIB-AIB-AIB-Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Kinine-analogen (K) met amino isoboterzuur (AIB) getest op het vinkje recombinante kinine receptor. Ac: acetyl; α Me: α methyl-fenylalanine, β3F: β3-fenylalanine, een: amide.

<ol>
	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs.">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biostable+agonists+that+match+and/or+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs.">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond,+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus.">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+and+non-selective,+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+and+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li><li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

We waren in staat om de functionele karakterisering van de eerste neuropeptide receptor ontdekt van de Arachnida (teken, mijten en spinnen), de teek kinine-receptor te voeren, met behulp van dit protocol. Deze methode heeft drie primaire applicaties. Ten eerste kan de techniek worden toegepast voor de receptor ligand deorphanization door middel van activiteiten metingen. Ten tweede, kan de test op te lossen ligand-receptor structuur-activiteit relaties (SAR). Ten derde kunnen de methoden worden gebruikt in drug discovery. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt om de activiteit van agonisten of antagonisten op bijna elk GPCR te bestuderen. We beginnen om dit protocol aan te passen voor de screening van kleine bibliotheken. De cellijn we gebruik gemaakt drukt niet de alomtegenwoordige G-eiwit G 16. We hebben geen behoefte aan omdat geleedpotigen kinine-receptoren het signaal via de Gq eiwit en de intracellulaire calciumconcentratie cascade en ze sparen dit signalering eigenschappen in zoogdiercellen zoals hier te zien.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO-K1-cellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, USA </td></tr><tr><td> F12K medium </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotica-Antimycoticum </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM ik Verminderde Serum Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticine </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep draaien Miniprep kit </td><td> Qiagen Inc </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene 6 transfectiereagens </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well witte dunne bodem microtitere plaat </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> calcium-vrij DMEM media </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Bright-Line hemacytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijke </td><td></td><td> Horsham, PA </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism-software 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc </td><td></td><td> San Diego, CA, USA </td></tr><tr><td> T-25 en T-75 Kolven </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 en 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

Geleedpotige hormoon-receptoren zijn potentiële doelwitten voor nieuwe pesticiden als ze veel essentiële fysiologische en gedragsmatige processen te reguleren. De meerderheid van hen behoren tot de superfamilie van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s). Hebben we ons gericht op het karakteriseren van geleedpotige kinine-receptoren van de teek en de mug. Geleedpotige kinins zijn multifunctionele neuropeptiden met myotropic, diuretisch, en neurotransmitter functie. Hier, een methode voor systematische analyse van de structuur-activiteit-relaties van insecten kinins op twee heterologe kinine-receptor-expressie systemen wordt beschreven. Wij leveren belangrijke informatie die relevant is voor de ontwikkeling van biologisch stabiel kinine-analogen met het potentieel om het diureticum, myotropic, en / of de spijsvertering processen in teken en muggen te verstoren. De kinine-receptoren van de zuidelijke vee teek, Boophilus MicroPlus (Canestrini), en de mug Aedes aegypti (Linnaeus), waren stabiel uitgedrukt in de zoogdiercellijn CHO-K1. Functionele analyses van deze receptoren werden afgerond met behulp van een calcium-bioluminescentie plaat test die intracellulaire bioluminescentie maatregelen om de cytoplasmatische calcium te bepalen bij de peptide toepassing op deze recombinante cellen. Deze methode maakt gebruik van de aequorine eiwit, een photoprotein geïsoleerd van lichtgevende kwallen. We tijdelijk getransfecteerd het aequorine plasmide (mtAEQ/pcDNA1) in cellijnen die stabiel tot expressie van de kinine-receptoren. Deze cellen werden vervolgens behandeld met de cofactor coelenterazine, die complexen met intracellulaire aequorine. Deze band breekt in de aanwezigheid van calcium, uitzenden luminescentie niveau indicatie van de calciumconcentratie. Omdat de kinine-receptor-signalen door het vrijkomen van intracellulaire calcium, is de intensiteit van het signaal met betrekking tot de potentie van het peptide. Dit protocol is een synthese van een aantal eerder beschreven protocollen met wijzigingen; presenteert stap-voor-stap instructies voor de stabiele expressie van GPCR&#39;s in een zoogdiercellijn door middel van functionele plaat assays (Staubly et al., 2002 en Stables et al., 1997.. ). Met behulp van deze methodologie, waren we in staat om stabiele cellijnen uiting van de mug en de teek kinine-receptoren vast te stellen, de potentie van drie mug kinins vergelijken, kritieke aminozuur posities voor de ligand-receptor interactie, en het uitvoeren van semi-throughput screening van een peptide bibliotheek. Omdat insecten kinins zijn vatbaar voor snelle enzymatische afbraak door endogene peptidasen, worden ze ernstig beperkt in gebruik als instrumenten voor bestrijding van ongedierte of endocrinologische studies. Daarom hebben we ook getest kinine-analogen met amino isoboterzuur (AIB) om hun potentie en biostability te verbeteren. Dit peptidase-resistente analoog is een belangrijke voorsprong in de ontwikkeling van biologisch stabiel insecten kinine-analogen en kan helpen bij de ontwikkeling van neuropeptide-gebaseerde geleedpotige controle strategieën.

Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Dit protocol bevat instructies voor het klonale-cellijn selectie en een calcium-bioluminescentie test om de structuur-activiteit relaties van gesynthetiseerd geleedpotigen neuropeptiden op hun verwante GPCR&#39;s te analyseren. Deze test kan gebruikt worden voor receptor deorphanization en structuur-activiteit relatie studies voor synthetische analoog ontwerp en peptide / drug-lead discovery.

Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Een protocol voor het verzamelen en Kleuring Hemocytes uit de Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Speeksel, speekselklieren en hemolymfe Collectie van Ixodes scapularis Teken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Opfok<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; De Black-legged Tick: Het voeden van onvolwassen stadia op muizen

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Kraal gebaseerd Multiplex Assay voor analyse van Tear Cytokine profielen

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation Assay voor het bestuderen van functionele interacties tussen receptoren en enzymen

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Menselijk Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G detectie van cel-gebaseerde Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Het onthullen van Hemolymph inzameling en inenting van anisopliae Blastospores in Rhipicephalus Microplus teken naar ongewervelde pathologie studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...