Name: a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00
Duration: 10 min 46 s
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博士。コペンハーゲン大学（デンマーク）からCJP Grimmelikhuijzenとマイケルウィリアムソンは、イクオリンはプラスミドの提供のために高く評価されています。私達の協力者、ARS - USDA（米国テキサス州）からのロナルドJ. Nachmanは、ペプチド合成のためとNOVOstarプレートリーダーを提供するための知られています。

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	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs.">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biostable+agonists+that+match+and/or+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs.">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond,+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus.">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+and+non-selective,+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+and+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li><li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、このプロトコルを使用して、クモ（ダニ、ダニやクモ）、ダニのキニンの受容体から最初に検出された神経ペプチド受容体の機能解析を行うことができた。このメソッドは、主に次の3つのアプリケーションを持っています。最初に、技術はリガンド活性の測定によって受容体のdeorphanizationに適用することができます。第二に、アッセイは、リガンド - 受容体の構造活性相関（SAR）を解決することができます。第三に、メソッドは、創薬に使用することができます。さらに、このプロトコルは、ほとんどすべてのGPCRに関するアゴニストまたはアンタゴニストの活性を研究するために使用することができます。私たちは、小さなライブラリーのスクリーニングのためにこのプロトコルを適応し始めている。我々が利用細胞株では、ユビキタスGタンパク質G 16を発現しない。我々は、Gqをタンパク質と細胞内カルシウムのカスケードを通して節足動物キニン受容体のシグナルので、それを必要としなかったし、ここに示すように、彼らは、哺乳動物細胞でこのシグナル伝達特性を節約。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO - K1細胞</td><td> ATCC </td><td> CCL - 61 </td><td>マナッサス、VA、アメリカ合衆国</td></tr><tr><td> F12K培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA（10倍） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td>抗生物質、抗真菌</td><td>インビトロジェン</td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td>のOpti - MEM Iは、血清培地を削減</td><td>インビトロジェン</td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td>リポフェクチン試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td>インビトロジェン</td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td>インビトロジェン</td><td> C663 - 03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprepキット</td><td>キアゲン社</td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6トランスフェクション試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェル白色の薄い底のmicrotitereプレート</td><td>共演スター</td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td>カルシウム不含DMEM培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td>セレンテラジン</td><td>インビトロジェン</td><td> C - 2944 </td><td></td></tr><tr><td>ブライトライン血球計</td><td> Hausserサイエンティフィック</td><td></td><td>ホーシャム、ペンシルバニア州</td></tr><tr><td> NOVOstar </td><td> BMGのLabtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td>プリズムソフトウェア4.0 </td><td>グラフパッドソフトウェア株式会社</td><td></td><td>サンディエゴ、カリフォルニア州、米国</td></tr><tr><td> T - 25およびT - 75フラスコ</td><td> BDファルコン</td><td> 353014と353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

彼らは多くの重要な生理学的および行動のプロセスを調節すると節足動物のホルモン受容体は、新規農薬の潜在的なターゲットです。それらの大半は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）のスーパーファミリーに属する。我々は、ダニや蚊から節足動物キニン受容体を特徴付けるに焦点を当てている。節足動物のキニンはmyotropic、利尿、および神経伝達物質の機能を備えた多機能神経ペプチドである。ここでは、二つの異種キニン受容体を発現しているシステム上の昆虫キニンの構造活性相関の系統的分析のための方法が記載されている。我々は、利尿、myotropic、および/またはダニや蚊の消化過程を妨害する可能性のある生体安定キニン類似の開発に関連する重要な情報を提供しています。 南部牛のダニ、 ウシマダニ属microplus（Canestrini）、及び蚊ネッタイシマカ （リンネ）、からキニン受容体を安定に哺乳類細胞株CHO - K1で発現させた。これらの受容体の機能解析は、これらの組換え体細胞にペプチドアプリケーションによって細胞質カルシウム濃度を決定するために細胞内の生物発光を測定するカルシウムの生物発光プレートアッセイを用いて完成した。このメソッドは、イクオリンの蛋白質、発光クラゲから単離された発光タンパク質を利用しています。我々は、一時的に安定してキニン受容体を発現する細胞株で（mtAEQ/pcDNA1）エクオリンプラスミドをトランスフェクション。これらの細胞は、どの細胞イクオリンと複合体因子のセレンテラジン、で処理した。この結合はカルシウム濃度を示す発光レベルを放出、カルシウムの存在下で分解。キニン受容体が細胞内カルシウムの放出を介して信号として、信号の強度は、ペプチドの効力に関連しています。 このプロトコルは、変更といくつかの以前に記載されているプロトコルの合成であり、。。、それは機能的なプレートアッセイ（Staubly ら 、2002年と厩舎ら 、1997年まで哺乳類細胞株におけるGPCRの安定した発現のためのステップバイステップの手順を説明）。この手法を用いて、我々は蚊やダニのキニン受容体を発現する安定細胞株を樹立することができた、三蚊のkininsの効力を比較し、リガンドとレセプターの相互作用に重要なアミノ酸位置を特定し、ペプチドの半スループットスクリーニングを行うライブラリ。昆虫キニンは内因性ペプチダーゼによる高速酵素分解を受けやすいので、それらは深刻な害虫駆除や内分泌学的研究のためのツールと​​して使用が制限されています。したがって、我々はまた彼らの効力とbiostabilityを強化するアミノ酸イソ酪酸（AIB）を含むキニン類似をテストした。このペプチダーゼ抵抗性アナログは、生体安定昆虫キニン類似体の開発において重要なリードを表し、神経ペプチドベースの節足動物の制御戦略の開発を支援することがあります。

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

このプロトコルは、クローン細胞ラインの選択とその同族のGPCRで合成された節足動物の神経ペプチドの構造活性相関を分析するためにカルシウムの生物発光アッセイの手順について説明します。このアッセイは、受容体のdeorphanizationと合成アナログ設計およびペプチド/薬物リード発見のための構造活性相関の研究にも使用できます。

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