Name: a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

Dr. CJP Grimmelikhuijzen och Michael Williamson från Köpenhamns universitet (Danmark) är uppskattade för att tillhandahålla aequorin plasmiden. Vår samarbetspartner, Dr Ronald J. Nachman från ARS-USDA (TX, USA), är känd för peptidsyntes och för att tillhandahålla Novostar plattläsaren.

1. Inrättande av stabila cellinjer <ol><li> Klon din GPCR av intresse och sätt in det i ett uttryck vektor som innehåller ett 5 &quot;Kozak konsensus sekvens (GCCA / GCCATGG) runt starten kodon för optimal ribosomal bindande i ett däggdjur system (Kozak, 1986). Här använder vi plasmiden pcDNA3.1/Bm-KR för fästingen kinin-receptorn, och plasmid pcDNA3.1/Aedae-KR för mygga kinin-receptorn (Holmes et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005.). Den pcDNA3.1 (-) vektor kodar ampicillin motstånd för val i bakterier och neomycin (G418) motstånd för val i däggdjursceller. </li><li> Grow CHO-K1 tomma celler (utan plasmider) (ATCC, Manassas, VA, USA) eller annan önskad cell linje i en T-25 kolv (BD Falcon) vid 37 ° C i en 5% CO 2 fuktas inkubator (Holmes et al ., 2003). Alla ytterligare inkubationer bör ske under sådana förhållanden om inte annat anges. Behåll de tomma cellerna i odlingsmedium (F12K medium med 10% fetalt bovint serum) med 1X Antibiotikaassocierad Antimykotika (Invitrogen, CA). </li><li> För att dela celler, värma upp alla lösningar till 37 ° C. Ta bort gamla mediet i T-25 kolv och skölj med 5 ml PBS och ta sedan bort PBS. För att trypsinize celler, tillsätt 2 ml PBS-Trypsin-EDTA (34 ml PBS, 2 ml 7,5% natriumbikarbonat, 4 ml 10X trypsin-EDTA) i 2 min. Tillsätt 3 ml medium och aspirera medelstora upp och ner för att blanda celler. Överföringsmedium med celler i en konisk rör och centrifugera i 2 min vid ~ 200-300 g (1000 rpm). Kassera supernatanten och återsuspendera celler i 5 ml medium. Späd den återsuspenderade cellerna till en koncentration av 1:05 eller 1:10 med färska medelstora och överföra 5 ml i en ny T-25 kolven. </li><li> Efter att cellerna växer hälsosamt (ca 2-3 dagar), utsäde CHO-K1-celler i T-25 flaskor vävnadsodling och växa dem över natten i tillväxt medium utan antibiotika tills de är ca 30% konfluenta (ca 18 timmar). Graden av confluency kan bestämmas genom att observera celler under inverterad fluorescerande mikroskopi. </li><li> Förbered följande blandningar för varje prov: <ol><li> Kombinera 1-2 mikrogram DNA (Exempel: Använd 4μl av 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) med 100 l Opti-MEM jag Minskad Serum Medium (Invitrogen). </li><li> Blanda 6 l Lipofectin Reagent (InvitrogenTM) i 100 l F12K serum fritt medium, vilket gör en 1:1 förhållande Lipofectin till DNA. Inkubera vid rumstemperatur i 30-45 min. </li></ol> Blanda försiktigt lösningar från 1.5.1 till 1.5.2 i ett droppvis mode (total volym = 200 mikroliter). Låt stå i rumstemperatur i 10-15 min. </li><li> Ta bort det gamla tillväxtmedium från cellerna och tvätta cellerna med 5 ml F12K serum fritt medium och sedan ta bort F12K serum fritt medium. I en 15 ml tub, försiktigt blanda transfektion blandningen i 1,8 ml rent F12K medium i ett droppvis mode. Sedan tvättade cellerna från steg 1,5 med PBS och lägga till denna nya transfektion lösning på cellerna. Inkubera i 18 timmar. </li><li> Ändra på medellång till F12K medelstora plus 10% fetalt bovint serum utan antibiotika och inkubera över natten. Dela upp celler i två T-25 flaskor med F12K medelstora plus 10% fetalt bovint serum utan antibiotika i ytterligare 18 timmar (för att dela celler, se steg 1.3). </li><li> Byt medium med selektivt medium (F12K medelstora plus 10% fetalt bovint serum med 800μg/ml GENETICIN, Invitrogen). Kultur cellerna med hjälp av selektivt medium i 3-4 veckor. Med tiden kommer detta att välja för celler som stabilt har införlivat plasmiden i deras genomiska DNA. Fortsätt att hålla cellerna med hjälp av underhåll medium (F12K medelstora plus 10% fetalt bovint serum med 400μg/ml GENETICIN). Periodvis frysa cellinjer med 1:1 förhållandet frysning medier (selektivt medium med 20% DMSO) för att förhindra förlorar vid oväntad smitta. </li><li> Välja klonat cellinjer: som ett första steg, trypsinize och centrifugera cellerna från steg 1,8 med underhåll medium som i steg 1,3. Återsuspendera cellerna i 5 ml underhåll medium, ta 0,5 ml av cellen avbryta och tillsätt 4,5 ml rent underhåll medel för att göra en 10x utspädning. Överför 10x utspädningen i 12 brunnar i en 96 brunnar, lägga 100 l till varje brunn för att välja för enstaka celler. </li><li> Fortsätt att göra 10x spädningar av dessa celler för en teoretisk sista suspension av en cell per 100 l (normalt den slutliga utspädningen kommer att vara i intervallet 10 -11 till 10 -19, det totala antalet 10x seriespädningar är ~ 19) . Omedelbart efter varje spädning, överföring 100 ìl av utspädningen i 12 brunnar i 96 brunnar. Efter 18 timmars inkubation, observera 96 ​​brunnar under en inverterad ljus eller fluorescensmikroskop och markera brunnar som ser ut att bara innehålla en enda cell eller innehålla två celler som uppenbarligen delas från en enda cell. Håll observera varje dag och förändring medelstora var tredje dag. </li><li> När brunnarna är 80% confluENT (ungefär en vecka), skölj markerade brunnar med 200 l PBS och trypsinize dem med 100 l PBS-trypsin-EDTA-lösning. Överför celler från varje markerad väl in en brunn i en 6-brunnar med 1 ml underhåll medium. Väx dessa celler i 3 dagar och överför sedan cellerna i enskilda T25 kolven. Testa dessa celler med hjälp av analysen kalcium mareld med agonistisk peptider (se avsnitt 2). </li><li> Välj en cellinje från steg 1,11 med den högsta respons i kalcium mareld plattan analys och utföra en andra gång den enda cellmarkeringen följande steg från 1,9 till 1,11. Periodvis frysa cellinjer. </li><li> Från den sekundära val beskrivs i steg 1,12, välj 2-3 cellinjer med den högsta respons i kalcium mareld plattan analysen och hålla dem i kultur för ytterligare tallriken kalcium bioluminescens analyser. Håll koll på passagen nummer. Från tid till annan, frysa cellinjer från början av passager så att du kan alltid gå tillbaka till dem om cellinjer med fler passager sluta utföra konsekvent. </li></ol> 2. Även kalcium bioluminescence plattan analys <ol><li> Ligate reportern genen av intresse i ett uttryck vektor. Här har vi använt aequorin plasmid mtAEQ/pcDNA1 (en gåva från Dr. CJP Grimmelikhuijzen och Michael Williamson, Köpenhamns universitet, Danmark). Omvandla den plasmiden i E. coli-celler MC1061/PS (Invitrogen) och rena dem med en QIAprep spin miniprep kit (Qiagen Inc.). I det sista steget eluera plasmiden med Tris-buffert utan EDTA, inte vatten. </li><li> Grow cellinjer från steg 1,13 manifesterar den önskade receptorn i underhåll medium. När cellerna är 90% konfluenta, trypsinize, centrifug och sedan avbryta cellerna i 5 ml underhåll medium som i steg 1,3. Späd celler (ca 10x med underhåll medium) och räkna antal celler med celltalsräknare (Ljus-Line Hemacytometer) under mikroskopi. Justera mobilnummer till cirka 2 x 10 5 celler / ml (i genomsnitt 20 celler i en av de nio rutorna visade i Hemacytometer). Seed 2 ml utspädd celler i media i varje brunn i en sex brunnar. Inkubera under 24 timmar (de celler bör nå ca 60% confluency efter inkubation). </li><li> Ändra media i sex brunnar plattan OPTI-MEM medium. För varje brunn, blanda 96 l OPTI-MEM med 4 l FuGENE 6 Transfektion reagens (Roche Biochemicals) i ett mikrofugrör och låt sitta i rumstemperatur i 5 minuter. Tillsätt 1 mikrogram aequorin / pcDNA 1 plasmid-DNA i varje rör och sedan försiktigt skaka provet i 1 min, inkubera vid rumstemperatur i 15-20 min. Tillsätt varje blandning i varje brunn i en droppvis sätt samtidigt som du försiktigt skaka väl plattan. Inkubera plattorna under 6 timmar och ändra medellång till F12K medium som innehåller 10% fetalt bovint serum utan antibiotika. </li><li> Efter inkubering av cellerna i sex brunnar i 24 timmar, trypsinize, centrifug och återsuspendera cellerna som steg 1,3. Räkna mobilnummer till 400.000 celler / ml som steg 2,1 och överföra 100 l (totalt 40.000 cells/100 l) i varje brunn på en 96-såväl vit tunn botten mikrotiterplatta (Costar 3610). Inkubera i ytterligare 24 timmar tills ca 80% cell confluency. Detta är den optimala koncentrationen av celler för bioluminescence analysen. </li><li> Förbered 90μl/well av kalcium-fri DMEM media (Invitrogen) som innehåller 5 mikroM coelenterazine (Invitrogen) i mörker (coelenterazine är ljuskänsligt). Ta plattan från 2,4, ta bort gamla medier och lägga till denna 90μl i varje brunn. Inkubera plattorna i 3 timmar i mörker vid 37 ° C och 5% CO 2, varefter celler i plattan är redo att testas. </li></ol> 3. Instrument drift och dataanalys <ol><li> Varje bioluminescens plattläsaren är annorlunda. Vi utför analys med hjälp av en Novostar (BMG Labtechnologies) plattläsaren i bioluminensence läge. Om du använder ett annat instrument, måste du anpassa protokollet. </li><li> Rensa pumparna plattläsaren (eller PRIME pumpar) före användning. Stäng av ljuset i rummet innan du sätter plattan på hållare. När hållare har stängt, slå på belysningen. </li><li> Löses peptider (i ett 1,5 ml Eppendorf-rör) i kalcium-fria DMEM medier. Ställ in &quot;Aspirera Djup&quot; och &quot;positionsbestämning&quot; av peptiden lösningen före användning. Utmana cellerna med 10 l (10x) av varierande koncentrationer av peptider (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, eller annan önskad peptid) och omedelbart börja spela in ljuset utsläpp. Vi har satt instrumentet för att spela in ljus utsläpp (465 nm) för varje brunn varje 2 sekunder för en total tid på 50 sekunder. </li><li> Se till att inkludera en positiv kontroll, såsom en aktiv analog (analog FFFSWGa har använts, Taneja-Bageshwar et al., 2009) och en negativ kontroll såsom vektor bara transfekterade cellerna. Den negativa kontrollen kommer att bli nödvändiga under dataanalys för att ställa baslinjen tröskeln (se representativa resultat).En oberoende, inaktiv peptid kan också läggas som en negativ kontroll. </li><li> När körningen är klar, tvätta instrumentet pumpen (eller PRIME pumpar) placera sedan din nästa peptid prov. Spara dina data och tvätta pumparna igen. </li><li> Datahantering: Överför data från ljus utsläpp från varje brunn i en Microsoft Excel-datablad. </li><li> Klistra in data från Excel till Prism programvara 4,0 från GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, USA). De olika peptidnivåer är X-axeln och bioluminescens enheter är Y-axeln. Att normalisera data tomten en logg-respons-kurva. Välj en icke-linjär regressionsanalys kurvanpassade (sigmoidal dos-respons-ekvationen med variabel lutning) för att få koncentration-respons-kurvor för varje peptid. Programmet tomter värdena i slutet och ger EG-50. </li><li> Varje försök bör upprepas tre gånger för dataanalys. </li></ol> 4. Representativa resultat: Uttryckt i CHO-K1-celler, betedde sig mygga Aedes aegypti kinin-receptorn som en multiligand receptor och funktionellt svarade på så låga koncentrationer som 1 nM av de tre endogenours Aedes kinins, Aedae kinins 1-3, testade ensamma med kalcium analys mareld tallrik . Figur 1 visar att rangordningen av styrka erhållit var Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, baserat på respektive EC 50 värden Aedae-K-3, 16,04 nm, Aedae-K- 2, 26,6 nM och Aedae-K-1, 48,85 Nm, vilket var statistiskt signifikant (p &lt;0,05) (Pietrantonio et al., 2005). Vi använde också denna analys för att avgöra vilka kinin rester är kritiska för kinin-peptid-receptor interaktion. Insect kinin peptider delar en C-terminal pentapeptide som representerar den minimala sekvensen som krävs för biologisk aktivitet, även känd som kärna. I tabell 1 var kinin-peptiden kärnan analoger syntetiseras som ett Alanine ersättning serien av kärnan kinin pentapeptide FFSWGa och testats av ett kalcium mareld plattan analys (Taneja-Bageshwar et al., 2006). Vi fann att aminosyrorna Phe 1 och Trp 4 var viktigt för verksamheten i insekten kinins för båda receptorerna. Analysen kan också användas för att testa peptider utformad för ökad biostability. Tabell 2 visar utformade kinin-analoger som innehåller aminosyran isobutyratanhydrid syra (AIB) testas på fästingen rekombinant kinin-receptorn och Figur 2 visar aktiviteten jämförelse av sex alfa-amino isobutyratanhydrid syra analoger på fästingen kinin-receptorn uttrycka CHO-K1 cellinje av kalcium bioluminescence plattan analys (Taneja-Bageshwar et al., 2009). Den hexapeptide analoga FFFSWGa läggs för en positiv kontroll för receptoraktivitet. Den analoga FF [AIB] WGA resulterat mer aktiv än så hexapeptide kontroll analog. Den analoga med två aminoisobutyric syra ersättare, [AIB] FF [AIB] WGA, var den mest potenta av dubbel-byte-analoger testade (tabell 2 och figur 2). För fler exempel på hur denna analys har varit och kan tillämpas se Nachman och Pietantonio (2010), Nachman et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a), och Taneja-Bageshwar et al. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Uppskattning av Aedes kinins effektiv koncentration (EC 50) på CHO-K1 E10 celler genom en kalcium-mareld plattan analys. Y-axeln i koncentration-respons-kurvor har erhållits från mareld enheter uttryckt i procent av maximal respons noterats för varje peptid. Datapunkter representerar ett genomsnitt av sex replikat som erhållits under tre oberoende försök. Stapel avser medelfel. (A) Uppskattning av Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Uppskattning av Aedae-K2 EG 50 = 26 nM. (C) Uppskattning av Aedae-K3 EG 50 = 16 nM. EG 50 Aedae-K3 &lt;EG 50 Aedae-K2 &lt;EG 50 Aedae-K1, P &lt;0,05. Statistisk analys och diagram var med GraphPad Prism 4,0 mjukvara. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Aktivitet jämförelse av sex alfa-amino isobutyratanhydrid syra analoger på fästingen kinin-receptorn uttrycka CHO-K1 cellinje av en kalcium bioluminescens tallrik analys. Y-axeln representerar procent maximal mareld enheter för varje analog uttryckt som en procentandel av mareld observeras vid en koncentration kontra maximal respons observerats bland alla analyserade koncentrationerna för varje analog. Statistisk analys och grafer utfördes med GraphPad Prism 4,0 mjukvara. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Kryssa i linje receptor cell </td><td colspan="2"> Mosquito receptor cellinje </td></tr&gt; <tr><td> Peptider </td><td> EC 50 (nm) </td><td > Maximal bioluminescence svar vid 1 mM </td><td> EC 50 (nm) </td><td> Maximal bioluminescence svar vid 1 mM </td></tr><tr><td> AFSWGa </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12.800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10.600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10.800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td><td> Jag </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13 tusen </td><td> 562 </td><td> 10 tusen </td></tr><tr><td> FF [AIB] WGA </td><td> 29 </td><td> 12.700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Beräknad potencies (EG 50) och maximal mareld svar på alla peptider testat på fästing och mygga receptor transfekterade cellinjer *. * EG 50 beräknar koncentrationen som krävs för att inducera en halv maximal respons. I: Inaktiv om bioluminescens svar är mindre än 300 enheter (nivå av vektor-only transfekterade celler). A: position där respektive återstoden i peptiden FFSWGa har ersatts av alanin. ND: Den analoga testades, men var antingen inte särskilt aktiv eller inte aktiv vid lägre molarities, alltså en EC50 inte kunde fastställas. <table border="1"><tbody><tr><td> K-AIB-1 </td><td> [AIB] FF [AIB] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-2 </td><td> [Α MEF] FF [AIB] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-3 </td><td> Ac-R [AIB] FF [AIB] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [AIB] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-5 </td><td> [AIB] RFF [AIB] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-6 </td><td> [AIB-AIB-AIB-AIB] RFF [AIB] WGA </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Kinin analoger (K) som innehåller aminosyran isobutyratanhydrid syra (AIB) testas på fästingen rekombinanta kinin-receptorn. AC: acetyl; α mig: α-metyl-fenylalanin, β3F: β3-fenylalanin, en: amid.

<ol>
	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs.">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biostable+agonists+that+match+and/or+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs.">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond,+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus.">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+and+non-selective,+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+and+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li><li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

Vi kunde utföra den funktionella karakteriseringen av de första neuropeptid receptorn upptäcktes från Arachnida (fästingar, kvalster och spindlar), fästingen kinin-receptorn, med hjälp av detta protokoll. Denna metod har tre huvudsakliga användningsområden. Det första kan tekniken användas för receptorn deorphanization genom mätningar ligand aktivitet. För det andra kan analysen lösa ligand-receptor struktur-aktivitetssamband (SAR). Tredje kan de metoder som används inom läkemedelsforskning. Dessutom kan detta protokoll användas för att studera aktiviteten av agonister eller antagonister på nästan alla GPCR. Vi börjar att anpassa detta protokoll för screening av små bibliotek. Den cellinje vi utnyttjat uttrycker inte den allestädes närvarande G-protein G 16. Vi behövde inte det eftersom leddjur kinin-receptorer signal via GQ protein och den intracellulära kalcium kaskad och de bevara denna signalering fastigheter i däggdjursceller som visas här.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO-K1-celler </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, USA </td></tr><tr><td> F12K medelstora </td><td> Invitrogen </td><td> 21.127 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovinserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15.400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotika </td><td> Invitrogen </td><td> 15.240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM jag Minskad Serum Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 31.985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep spin miniprep kit </td><td> Qiagen Inc. </td><td> 19.064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfektion reagens </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96-såväl vit tunn botten microtitere tallrik </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> kalciumfri DMEM medier </td><td> Invitrogen </td><td> 21.068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Bright-Line Hemacytometer </td><td> Hausser Vetenskapliga </td><td></td><td> Horsham, PA </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism programvara 4,0 </td><td> GraphPad Software Inc. </td><td></td><td> San Diego, CA, USA </td></tr><tr><td> T-25 och T-75 Kolvar </td><td> BD Falcon </td><td> 353.014 och 353.135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

Leddjur hormonreceptorer är potentiella mål för nya bekämpningsmedel som de reglerar många viktiga fysiologiska och beteendemässiga processer. De flesta av dem hör till superfamiljen av G-protein-kopplade receptorer (GPCRs). Vi har fokuserat på att karakterisera leddjur kinin-receptorer från fästingen och mygga. Leddjur kinins är multifunktionella neuropeptider med myotropic, urindrivande och neurotransmittor funktion. Här, en metod för systematisk analys av struktur-aktivitetssamband av insekter kinins på två heterologa kinin-receptor-uttrycka-system beskrivs. Vi ger viktig information av betydelse för utvecklingen av biostable kinin-analoger med potential att störa den diuretiska, myotropic, och / eller processer mag i fästingar och myggor. Den kinin-receptorerna från södra boskapen fästingen, Boophilus MicroPlus (Canestrini) och myggan Aedes aegypti (Linné) var stabilt uttryckt i cellinje från däggdjur CHO-K1. Funktionell analys av dessa receptorer slutfördes med hjälp av ett kalcium analys mareld platta som mäter intracellulär mareld att avgöra cytoplasmisk kalciumnivåer efter peptid ansökan till dessa rekombinanta celler. Metoden drar nytta av aequorin protein, en photoprotein isolerad från självlysande maneter. Vi transfekterade tillfälligt i aequorin plasmiden (mtAEQ/pcDNA1) i cellinjer som stabilt uttryckte kinin-receptorer. Dessa celler har sedan behandlades med kofaktor coelenterazine, som komplex med intracellulär aequorin. Denna bindning bryts i närvaro av kalcium, som avger luminiscens nivåer vägledande av kalciumkoncentrationen. Som kinin-receptorn signalerna genom frisättning av intracellulära kalcium, är intensiteten i signalen gäller styrkan av peptiden. Detta protokoll är en syntes av flera tidigare beskrivits protokoll med ändringar, det visar steg-för-steg-instruktioner för den stabila uttryck för GPCRs i en cellinje från däggdjur genom funktionella platta analyser (Staubly et al, 2002 och stall et al, 1997.. ). Användningen av denna metod kunde vi etablera stabila cellinjer som uttrycker mygga och fästingen receptorer kinin, jämföra styrkan av tre mygga kinins, identifiera kritiska aminosyrapositionerna för ligand-receptor interaktion, och utföra semi-throughput screening av en peptid bibliotek. Eftersom insekt kinins är känsliga för snabba enzymatisk nedbrytning av endogena peptidaser, de är starkt begränsade i användning som verktyg för skadedjursbekämpning eller endokrinologiska studier. Därför testade vi också kinin-analoger som innehåller aminosyran isobutyratanhydrid syra (AIB) att öka sin potens och biostability. Detta dipeptidylpeptidas-resistenta analoga utgör en viktig ledande i utvecklingen av biostable insekter kinin-analoger och får stöd i utvecklingen av neuropeptid-baserade strategier leddjur kontroll.

Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Detta protokoll innehåller instruktioner för klonal-cellinje urval och en kalcium mareld analys för att analysera struktur-aktivitetssamband av syntetiskt leddjur neuropeptider på deras besläktat GPCRs. Denna analys kan användas för receptor deorphanization och struktur-aktivitetssamband studier relation för syntetisk analog design och peptid / drug-bly upptäckt.

En Kalcium bioluminescence-analys för funktionsanalys av Mosquito ( Aedes aegypti) Och Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G proteinkopplade receptorer

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Ett protokoll för insamling och färgning hemocyter från gula febern Mosquito Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliv, spottkörtel och hemolymfa Collection från Ixodes scapularis fästingar

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammar för funktionell genomik Analys av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

uppfödning<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; Black-legged Tick: Feeding omogna stadier på möss

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Bead baserat Multiplex Assay för analys av tår cytokin profiler

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamiska vidhäftning test för funktionell analys av anti vidhäftning terapier vid inflammatorisk tarmsjukdom

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation analysmetod för att studera funktionella interaktioner mellan receptorer och enzymer

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Humant Serum Anti-akvaporin-4 immunglobulin G identifiering av cellbaserade test

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Avslöja Hemolymfa insamling och inympning av Metarhizium blastospores till Rhipicephalus MicroPlus fästingar mot ryggradslösa patologi studier

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vektorkompetensanalyser på Aedes aegypti myggor med Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...