Name: flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health te verlenen: PO1 HL55798 (naar KL) en de American Heart Association Scientist Development Grant 0525532U (naar bijv.).

1. Isolatie van muizen aorta Institutionele IACUC commissie goedkeuring van de procedure is nodig om te werken met muizen. <ol><li> Bereid heparinzed PBS door het toevoegen van 1.000 eenheden heparine natrium tot 50 ml PBS en omdraaien van de buis te mengen. Bereid een lege collectie buis voor het bloed en een verzameling buis met PBS voor elke aorta te worden verzameld. Houd alle buizen op ijs. </li><li> Heparinize een injectiespuit voor het tekenen van bloed (0,1 ml van 1000 U / ml Hepar...

<ol>
	<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis.">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li><li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+in+atherosclerosis:+a+double-edged+sword.">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+influx+in+atherosclerosis.">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li><li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids:+a+validation+study.">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li><li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+"mock"+FL3+channel+in+flow+cytometry.">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li><li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent.">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li><li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice.">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li><li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells.">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li></ol>

Hier presenteren wij een flow-cytometrie-gebaseerde methode voor het onderzoek van de immuun cel samenstelling van muriene aorta. Het grote voordeel van deze methode is de mogelijkheid om aorta immuuncellen analyseren op een enkele cel niveaus en om de activering status van de aorta leukocyten karakteriseren. Deze methode is niet beperkt tot muriene aorta en we (ongepubliceerde gegevens) en anderen 10 gebruikte deze benadering van de menselijke specimens zoals interne mamma-arterie, aorta-kleppen en kransslag...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaal </td><td> Catalogusnummer </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> Collagenase XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNase I, type 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenase I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Biochemische Corporation </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Biochemische Corporation </td></tr></tbody></table>

flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas

Atherosclerose is een chronisch ontstekingsproces van middelgrote en grote schepen die wordt gekenmerkt door de vorming van plaques bestaande uit schuimcellen, immuuncellen, vasculaire endotheliale en gladde spiercellen, bloedplaatjes, extracellulaire matrix, en een lipide-rijke kern met uitgebreide necrose en fibrose van de omliggende weefsels. 1 De aangeboren en adaptieve armen van de immuunrespons betrokken zijn bij de initiatie, ontwikkeling en voortbestaan ​​van atherosclerose. 2, 3 Er is een aanzienlijke hoeveelheid bewijs dat verschillende subgroepen van de immuun cellen, zoals macrofagen, dendritische cellen, T-en B-lymfocyten, zijn aanwezig in de aorta&#39;s van gezonde en atherosclerose-gevoelige muizen 4. Daarnaast worden immuuncellen in de omliggende aorta adventitia, die een belangrijke rol van dit weefsel suggereert in atherogenese 2. Al enige tijd werd de kwantitatieve detectie van verschillende soorten immuuncellen, de activatie-status, en de cellulaire samenstelling binnen de aorta beperkt door de RT-PCR en immunohistochemische methoden voor de studie van atherosclerose. Er zijn maar weinig pogingen werden ondernomen om flowcytometrie met behulp van menselijke aorta uit te voeren, en een aantal problemen, zoals een hoge autofluorescentie, zijn gemeld 5,6. Human atherosclerotische plaques werden verteerd met collagenase 1, en vrije cellen werden verzameld en gekleurd voor CD14 + / + CD11c tot macrofaag-afgeleide schuimcellen te markeren. In deze studie werd een &#39;mock &quot;kanaal gebruikt om vals-positieve kleuring te vermijden. 6 necrotische materiaal accumuleren tijdens het verteringsproces leiden in een grote hoeveelheid puin dat een hoge autofluorescentie bij aorta-monsters genereert. U lost dit probleem, heeft een panel van negatieve en positieve controles voorgesteld, maar slechts twee kleuren kan worden toegepast in deze monsters. We hebben een nieuwe flow cytometrie-gebaseerde methode 7 om het immuunsysteem cel samenstelling te analyseren en te karakteriseren de activatie, proliferatie, differentiatie van immuuncellen in gezonde en atherosclerose-gevoelige aorta. Deze methode maakt het mogelijk het onderzoek van de immuun cel samenstelling van de aorta en opent mogelijkheden om een ​​breed spectrum van immunologische methoden voor het onderzoeken van het immuunsysteem van aspecten van deze ziekte.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Dit document presenteert een flow cytometrie-gebaseerde methode om het immuunsysteem samenstelling van de aorta&#39;s te onderzoeken. De paper illustreert ook een extra techniek die het mogelijk maakt te onderzoeken omringende adventitia en vaatwand afzonderlijk. Deze methode biedt mogelijkheden om fenotypische analyses van de aorta leukocyten uit te voeren en een aantal immunologische testen toe te passen voor atherosclerose studies.

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracellulaire kleuring en flowcytometrie om lymfocyten in muizen Aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren in een Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analyse van SAMHD1-beperking door flowcytometrie in humane myeloïde U937-cellen

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...