Name: flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione: PO1 HL55798 (a KL) e dell&#39;American Heart Association Scientist Development Grant 0525532U (a EG).

1. Isolamento di aorte murino Approvazione del comitato istituzionale IACUC della procedura è richiesto di lavorare con i topi. <ol><li> Preparare heparinzed PBS con l&#39;aggiunta di 1000 unità di eparina sodica a 50 ml di PBS e invertendo il tubo per mescolare. Preparare una provetta vuota per la raccolta del sangue e un tubo di raccolta contenente PBS per ogni aorta da raccogliere. Mantenere tutte le provette su ghiaccio. </li><li> Eparinizzare una siringa di sangue disegno (0,1 ml di...

<ol>
	<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis.">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li><li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+in+atherosclerosis:+a+double-edged+sword.">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+influx+in+atherosclerosis.">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li><li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids:+a+validation+study.">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li><li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+"mock"+FL3+channel+in+flow+cytometry.">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li><li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent.">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li><li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice.">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li><li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells.">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li></ol>

Qui, vi presentiamo un metodo di citometria a flusso basato per lo studio della composizione delle cellule immunitarie di aorte murini. Il principale vantaggio di questo metodo è la capacità di analizzare aortica cellule del sistema immunitario ad un livello singola cellula e di caratterizzare lo stato di attivazione dei leucociti aortica. Questo metodo non si limita a aorte murina e noi (dati non pubblicati) e altri 10 utilizzati questo approccio per analizzare campioni umani come arteria mammaria interna,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale </td><td> Numero di catalogo </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> Collagenasi XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Ialuronidasi </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNasi I, di tipo 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenasi I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenasi II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Corporation biochimici </td></tr><tr><td> Elastasi </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Corporation biochimici </td></tr></tbody></table>

flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas

L&#39;aterosclerosi è un processo infiammatorio cronico delle imbarcazioni medie e grandi dimensioni che è caratterizzata dalla formazione di placche composto da cellule schiumose, cellule del sistema immunitario, cellule muscolari lisce ed endoteliali, piastrine, matrice extracellulare, e un nucleo ricco di lipidi con necrosi estesa e fibrosi dei tessuti circostanti. 1 Il braccio innata e adattiva della risposta immunitaria sono coinvolti nello sviluppo di iniziazione, e la persistenza di aterosclerosi. 2, 3 Vi è un corpus significativo di prove che diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie, come i macrofagi, dendritiche cellule, linfociti T e B, sono presenti all&#39;interno della aorte di topi sani e aterosclerosi a rischio 4. Inoltre, le cellule immunitarie si trovano nel avventizia aortica circostante che suggerisce un ruolo importante di questo tessuto nell&#39;aterogenesi 2. Da qualche tempo, la rilevazione quantitativa di diversi tipi di cellule immunitarie, il loro stato di attivazione, e la composizione cellulare all&#39;interno della parete aortica è stato limitato mediante RT-PCR e metodi immunoistochimici per lo studio dell&#39;aterosclerosi. Pochi tentativi sono stati fatti per eseguire citometria a flusso utilizzando aorte umane, e una serie di problemi, come un autofluorescenza alto, sono stati riportati 5,6. Placche aterosclerotiche umane sono stati digeriti con collagenasi 1, e celle libere sono stati raccolti e colorate per CD14 + / CD11c + per evidenziare macrofagi derivati ​​da cellule schiumose. In questo studio, un canale &quot;finto&quot; è stato usato per evitare falsi positivi colorazione. 6 materiali necrotiche accumulano durante il processo di digestione dar luogo a una grande quantità di detriti che genera una autofluorescenza alta nei campioni aortica. Per risolvere questo problema, un gruppo di controlli negativi e positivi è stato proposto, ma solo doppia colorazione potrebbe essere applicata in questi campioni. Abbiamo sviluppato un nuovo flusso di citometria metodo basato su 7 per analizzare la composizione delle cellule immunitarie e caratterizzare l&#39;attivazione, la proliferazione, la differenziazione delle cellule del sistema immunitario in buona salute e aterosclerosi dell&#39;aorta a rischio. Questo metodo permette l&#39;indagine della composizione cellule immunitarie della parete aortica e apre possibilità di utilizzare un ampio spettro di metodi immunologici per le indagini degli aspetti immunitario di questa malattia.

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Questo articolo presenta un metodo basato citometria di flusso per studiare la composizione immunitario dei aorte. Il documento illustra anche una tecnica aggiuntiva che consente di esaminare avventizia circostante e parete del vaso a parte. Questo metodo apre la possibilità di eseguire analisi fenotipica dei leucociti aortica e applicare diversi saggi immunologici per gli studi di aterosclerosi.

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l&#39;identificazione dei linfociti sottoinsiemi all&#39;interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

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Isolamento delle cellule CD8 + T residenti neireni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analisi della restrizione di SAMHD1 mediante citometria a flusso in cellule mieloidi umane U937

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...